【Merck】肿瘤干细胞成球实验方案
实体肿瘤以三维(3D)空间构象生长，导致氧和营养的异质暴露，以及其他物理和化学压力。为了模拟三维空间构象，癌症研究已使用三维培养模型，因为在传统的二维(2D)单层培养中，氧(缺氧)、营养物质、代谢物和信号分子的扩散受限分布无法模拟。肿瘤干细胞(CSC)被定义为肿瘤内具有自我更新能力的一小部分细胞，在化疗治疗后经常驱动肿瘤进展和复发。传统上，肿瘤干细胞是从癌症细胞系和肿瘤活检中分离出来，并使用3D肿瘤球培养在含未定义血清的培养基中生长。本文报告了一种新定义的无血清肿瘤干细胞培养基，该培养基使用3D肿瘤球培养方法支持人前列腺(E006AA)和乳腺癌(MCF-7)癌细胞株的扩增。在三维肿瘤球培养的连续传代过程中，两种细胞都显示出持续增殖。除了稳定的增殖，在这种新的3D肿瘤干细胞培养基多次传代后，观察到表达肿瘤干细胞群的更多醛脱氢酶(ALDH)。
操作指南
利用成分明确无血清3D球体培养基在人前列腺癌和乳腺癌细胞系中实施肿瘤干细胞成球培养
一、试剂耗材准备
产品编号 | 说明 |
S3077C28075 | 3dGRO™ 球状体培养基 |
CLS3471 | Corning® Costar® 超低附着多孔板 |
SLM-220 | EmbryoMax® DMEM (1X), liquid, With 4,500mg/L Glucose, 2.25g/L Sodium Bicarb, without L-Glut and Sodium Pyruvate |
CT01 | MTT Cell Growth Assay Kit |
ES009 | p-NPP Single Reagent, Yellow, Alkaline Phosphatase Substrate (soluble) |
T4049 | 胰蛋白酶-EDTA 溶液 |
二、实验步骤
肿瘤球形成和扩张
1. 在新的纯化学细胞培养基3dGRO™ Spheroid Medium (S3077)中培养每孔40,000个细胞(10,000细胞/mL) 的E006AA人前列腺癌细胞系或MCF7人细胞系(86012803-1VL)三份，使用Corning® Costar® 超低粘附多孔板(CLS3471)。
2. E006AA细胞每7天用胰蛋白酶- EDTA (T4049)酶解连续传代，MCF7细胞每9天传代。
3. 肿瘤球的形成和增殖在培养过程中保持不变，在第5代或第6代停止培养。
4. E006AA细胞和MCF7 细胞也在EmbryoMax® DMEM -高糖、低碳酸氢溶液中培养，无丙酮酸钠(SLM-220-M)，以10%胎牛血清 (F8318) 贴壁培养为对照。
5. 1、3、5代后用MTT细胞生长检测试剂盒(CT01)检测增殖情况，用AldeRed ALDH检测试剂盒(SCR150)分析醛脱氢酶 (ALDH)表达情况。
肿瘤干细胞鉴定
肿瘤干细胞表达醛脱氢酶(ALDH)水平升高。AldeRed™ ALDH检测试剂盒可使用ALDH红移荧光底物基于醛脱氢酶(ALDH)表达进行活肿瘤干细胞鉴定和分离，允许同时使用包括GFP细胞系在内的绿色荧光报告物。
1. 干燥AldeRed 588-A试剂重悬在DMSO中，通 过添加2N HCl活化。
2. 将每个细胞样本悬浮在分析缓冲液中，并添加AldeRed 588-A试剂。
3. 立即将样品分成两管，其中一管含有DEAB，一种ALDH抑制剂。在37℃下进行反应30分钟，然后在检测缓冲液中洗涤一轮。
4. 在配有蓝和/或绿激光的血细胞计数仪器上使用PE和/或PE-TexasRed检测器（Guava, Muse, ACEA Novocyte, Beckman）执行AldeRed 588-A检测。
三、结果
• 在3dGRO™ 球体培养基中，MCF7和E006AA细胞在培养过程中均维持肿瘤球的形成和增殖。（图1/2/3）
• E006AA细胞在第一次传代时附着在平板上(图3A)，第二次传代前细胞未增殖，但在第3次传代时细胞开始增殖(图1)，并在3dGRO™ 球体培养基中开始形成肿瘤球(图3B)。
• 在3dGRO™球体培养基中，MCF7和E006AA与标准DMEM 2D培养相比，所有三次传代中增殖均保持在50~ 90% (MCF7)和140 ~ 180% (E006AA)左右。
• 在第3和第5代，MCF7细胞的ALDHHigh干细胞群在3dGRO™ 球体培养基中增加到8%左右，而正常(贴壁)培养的细胞不到4%。（图4A）
• 在第1、3和5代，E006AA细胞的ALDHHigh干细胞群在3dGRO™球体培养基中增加到7-13%，而正常(贴壁)培养的细胞不到4%。E006AA细胞的ALDHHigh群在3dGRO球体培养基上传代次数增加。（图4B）
图1.肿瘤细胞在3dGRO™ 球体培养基中的稳定生长。曲线图为3D肿瘤球培养的连续传代过程中，MCF7细胞和E006AA细胞的累积群体倍增情况。
图2.MCF7乳腺癌细胞在3dGRO™ 球体培养基中第1代(A)和第5代(B)的肿瘤球形成。
图3.E006AA前列腺癌细胞在3dGRO™ 球体培养基中第1代(A)和第5代(B)的肿瘤球形成。
图4.当肿瘤细胞在3D肿瘤球培养5代后，在3dGRO™ 球体培养基中生长时，A ALDHhigh肿瘤干细胞群的富集发生。
四、结论
• 在3dGRO™ 球体培养基中，MCF7细胞和E006AA细胞在培养过程中均维持肿瘤球的形成和增殖。
• 随着连续传代次数的增加，MCF7细胞和E006AA细胞在传代次数增加时都形成了更多的球体结构。E006AA细胞的形态变化更为明显。
•在3dGRO™ 球体培养基中，MCF7细胞和E006AA细胞均可观察到ALDHHigh干细胞数量的增加。在E006AA细胞中，这种增加更为显著。
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