【Merck】3D培养皮肤类器官作为人体表皮的体外模型

皮肤是人体最大的器官，具有多种功能，包括保护、吸收物质和调节体温。皮肤具有复杂的分层结构，由三个主要层组成：1) 表皮紧密排列的细胞形成了防止物质入侵和水分流失的屏障，并包括一个称为角质层的外层，由重叠的、无活的角质细胞组成，可防止例如紫外线辐射和病原体的威胁；2）真皮，它支持着表皮，包含神经末梢、汗腺、皮脂腺、毛囊和血管。真皮的基底层是由角质形成细胞不断进行有丝分裂以补充细胞的位置；3) 皮下层，或皮下组织，主要包含脂肪细胞并起到保护下层组织的作用，可以作为能量储备，并通过绝缘提供一定的温度调节。

历史上，动物模型被用于测试化妆品的毒性和功效以及测试透皮药物吸收功效。然而，出于伦理考虑，这些动物模型已逐渐被“无残忍”体外皮肤器官模型所取代，该模型使用人原代细胞及小室细胞培养来再现层状表皮结构。2013 年，欧盟率先全面禁止对化妆品进行动物试验（国际零残忍组织）。在此，我们将介绍一种利用人原代角质形成细胞(PHK)、真皮成纤维细胞（人原代成纤维细胞，PHF），胶原蛋白涂层的MilliCell® 培养插件及专有的3dGRO™ 皮肤分化培养基，在空气：液体界面培养中，引导角质形成细胞多种分化的人表皮皮肤模型的分步培养方案。

图1. 类器官人体皮肤培养方案概述。

皮肤细胞培养方案

重要提示:产生高质量3D皮肤培养的关键是人原代角质形成细胞(PHKs)和成纤维细胞(PHFs)的质量。只使用第1代或第2代的原代细胞，不要让细胞过度汇合。

1将1瓶人原代角质形成细胞(C-12001，C-12005， 102-05N)和人真皮成纤维细胞(C-12300, 106-05N)或NIH 3T3细胞在适当的生长培养基(C-20111，131-500，C-23110，116-500)中溶解。每隔一天更换新鲜的培养基，培养至细胞达到80-90%的融合。

2.准备胶原蛋白/PHF层(冰上准备)(总容量8ml)

 a.将6 ml大鼠尾胶原蛋白(08-115)加入15 ml锥形管中(浓度见批次特定数据表)。

 b.加入1.6mL 5X重构缓冲液(1.1% NaHCO₃, 0.025N NaOH，100 mM HEPES，5X DMEM/F12)

 混合均匀。避免在胶原蛋白中产生气泡。

 c.加入400µl PHFs (4×10⁶细胞/mL细胞悬液)或NIH 3T3细胞。完全混合，但避免产生胶原蛋白泡沫。本步骤在冰上进行。

 d.将400µL的胶原蛋白/PHF混合物直接加入到每个MilliCell插入式细胞培养小室(MCHT12H48)的中心。在加入时避免产生泡沫。将细胞培养小室/皿在37°C孵育至少30分钟便于完全聚合。在凝胶化后，胶原蛋白/PHF层在37°C的条件下不添加任何培养基，可保持使用长达5小时。

3. 在每个胶原蛋白/PHF层上放加入0.5 mL PHKs (4x105细胞/mL细胞悬液)。小心不要破坏胶原蛋白/PHF层，因为这可能会导致渗漏或收缩。在插件的外侧加入2ml角质细胞培养液，放入12孔的常规培养皿中。37°C过夜孵育。第二天，在不移除原培养基的情况下，在每个插件的内侧添加0.5 mL角质细胞培养基，并在37°C下孵育2天。PHKs应在胶原层上进行三天的液体培养。在第三天液体培养后，高质量的PHKs将接近100%聚合。

4. 第4天，从每个小室轻轻中吸出培养基。避免接触或损坏胶原蛋白层的表面。用无菌镊子将小室转移到每孔含有4.5 mL 3dGRO™皮肤分化培养基 (SCM310) 的深孔 12 孔板 (Greiner Bio-One 665110)中。

 注意：您必须在细胞培养小室外部添加准确计量的培养基，以使皮肤培养物保持在空气：液体界面中。如果在插件的外部添加了过多的培养基，这可能会迫使额外的培养基进入插件并浸泡皮肤表面，从而导致分化中断。

5.在37°C 下再孵育皮肤培养物10天。在10天的孵育过程中，每隔一天更换一次3dGRO™ 皮肤分化培养基，并去除细胞培养小室膜下方的任何气泡。3D皮肤培养10 天后，应产生大约8至10层的活上皮。

图2.类器官皮肤模型具有与新生儿皮肤组织相当的分层上皮形态。H&E染色的含有真皮和表皮分层层的体外皮肤培养和离体皮肤切片（A、B）。丝聚蛋白染色可识别角化角质形成细胞层（棕色）（C、D）。

图3. 类器官皮肤模型包含活跃增殖的角质形成细胞。BrdU(溴脱氧尿苷/5-溴-2'-脱氧尿苷)是核苷胸腺嘧啶的类似物，可用于使用BrdU特异性抗体鉴定增殖细胞。用抗BrdU抗体(棕色)(A)、H&E抗体(B)和抗聚丝蛋白抗体(棕色)(C)染色的体外皮肤模型识别真皮基底层内增殖的细胞。

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