【Merck】人iPS细胞分化为气道上皮肺类器官

肺类器官是常用的三维(3D)细胞培养模型，用于研究人类肺部发育和呼吸道疾病，包括病毒感染(SARS-CoV、H1N1、MERS)、囊性纤维化、哮喘/COPD、空气污染暴露和吸烟的影响。与传统的永生化肺细胞系和原代细胞不同，肺类器官包含各种分化的细胞类型，具有复杂的组织结构，更接近于体内组织和功能。此外，肺类器官可以从少量患者组织或多能干细胞中提取，以创建有助于个性化生物医学研究的活体生物库。

3dGRO™ 人肺类器官培养系统是一种无血清、多阶段培养系统，常用于将人诱导多能干细胞(iPS)有效分化为结构类似于体内分支气道和早期肺泡结构的成熟肺类器官。使用3dGRO™ 人肺类器官培养系统，可以生成大量成熟的肺类器官，这些类器官表达适当的标志物，标志着成熟肺和气道中发现的多种细胞类型，包括在中发现的SFTPB和SFTPC（肺表面活性蛋白B和肺表面活性蛋白C）II 型肺泡上皮(ATII)细胞、MUC5AC（气道杯状细胞）、EpCAM、Sox9 和 Nkx2.1（肺内胚层）、乙酰-α-微管蛋白（纤毛细胞）和间充质标记波形蛋白。

此外，肺类器官还表达血管紧张素转换酶2 (ACE2)，它是导致COVID-19的新型 SARS-CoV-2病毒的受体，以及 TMPRSS2，一种协助SARS-CoV-2病毒入侵的丝氨酸蛋白酶。

图1.人肺类器官分化工作流程。 使用4天诱导培养基将人多能干细胞分化成定型内胚层细胞。在第4-8天，诱导培养基 (SCM305、SCM306) 将人定型内胚层细胞导向前肠内胚层 (AFE)。AFE细胞可以冷冻保存 (SCC301) 或使用 3dGRO™ 肺类器官分支培养基 (SCM307) 进一步分化成分支肺芽型类器官，并使用 3dGRO™ 肺类器官成熟培养基 (SCM308) 进一步成熟为分支型和肺泡型类器官。

肺类器官分化方案

第1步：人iPS 细胞分化为定型内胚层（第0-4天）

注意：从高品质未分化的人ES/iPS细胞(SCC271)开始，这些细胞汇合度约为70-80%，且含有<5%的分化细胞。以下方案用于六孔组织培养处理板中的一孔。指示的体积针对单孔。请根据需要调整用量。

1. 准备单细胞传代培养基。将ROCK抑制剂(ROCKi) Y-27632 (SCM075) 添加到7-10 mL人ES/iPS细胞扩增培养基 (SCM130) 中，最终浓度为10 μM。

2. 用ECM凝胶 (CC131) 涂抹6孔板。

3. 吸出培养基。用2 mL的DMEM/F12或1X PBS清洗孔。吸出1 mL Accumax™ 溶液 (A7089) 并将其添加到孔中。在37°C下孵育5-6分钟。手掌用力敲击板，以帮助去除细胞。

4. 向孔中加入1 mL单细胞传代培养基（来自步骤1）。用 5 mL移液器上下移液1-3次以移出细胞。小心不要吸入任何气泡。

5. 将解离的细胞收集在15 mL锥形管中。将1 mL的单细胞传代培养基添加到孔中，并将收集的所有剩余细胞转移到含有细胞悬浮液的15mL锥形管中。140xg离心管子5分钟并吸出上清液。

6. 将细胞沉淀重悬于1 mL单细胞传代培养基中。使用自动细胞计数器或Trypan blue (T8154) 和血细胞计数器计算活细胞总数。

7. 将每孔1x10⁶个细胞加入ECM Gel (CC131) 涂步后的6孔板中。使用单细胞传代培养基（从步骤1开始）。总体积=每孔3 mL。在37°C下孵育过夜。

8. 从孔中吸出培养基。将2mL的定型内胚层诱导培养基 (SCM302) 添加到孔中，并在 37°C下孵育过夜。

9. 在第2天和第3天重复第8步。在第4天通过流式细胞术分析细胞。在进行第2步之前，细胞的内胚层标志物CXCR4、c-Kit、Sox-17和FOXA2的阳性率应 >80% , PDGFR应为阴性。

第2步：DE细胞分化为前肠内胚层细胞（第4-8天）

注意：在定型内胚层细胞的第4天和分化为前肠内胚层 (AFE) 细胞后的第8天，应观察到细胞密度高。下面的方案提供了6孔板型的参考接种密度。调整其他板型的接种密度。

1. 从培养箱中取出含第4天定型内胚层培养物的6孔板。

2. 从每个孔中抽取培养基。用2ml 1X PBS (BSS-1006-B)洗净每孔。

3. 每孔加入1ml Accumax™溶液(A7089)，分离定型内胚层细胞。37°C孵育6-8分钟。

4. 5分钟后，目测检查平板。轻轻敲击平板的边缘，使细胞进一步分离。大多数细胞应该分离开并悬浮于液体中。如果不是，再孵育2分钟。

5. 每孔加入2ml 1X PBS (BSS-1006-B)稀释AccuMax™溶液(A7089)。将细胞悬浮液置于50ml锥形管中。用1ml 1X PBS冲洗每孔，收集任何剩余的细胞，并加入到50ml锥形管中。移液器上下抽吸几次以实现单细胞悬浮。

6. 室温下，细胞悬浮液130xg离心5分钟。

7. 吸出上清液。在2 mL 的AFE诱导培养基 I (SCM305) 中重新悬浮细胞颗粒。使用自动细胞计数器或血细胞计数器对细胞进行计数。在PBS中，将4 μg/mL的纤连蛋白 (F0895)涂在6孔板上。每个孔加入1.5 mL稀释的纤连蛋白。将涂有涂层的平板放置在2-8°C下过夜。吸出涂层溶液。盖上盖子，在防护罩中风干5分钟。当板干燥后，将板盖好盖子待用，直到细胞准备好。

8. 将1X10⁶个细胞铺板到纤连蛋白包被的6孔板的每个孔内。将适当体积的 AFE 诱导培养基I (SCM305) 添加到每个孔中，以达到每孔2 mL的总体积。

9. 将板置于37°C培养箱中。从一侧到另一侧、向前、向后轻轻晃动板，以确保细胞均匀分布在孔的表面。在 37°C下孵育过夜。

10.第5天：每孔更换2 mL AFE 诱导培养基II (SCM306)。在37 °C下孵育24小时。

11.第6天：用每孔2mL的3dGRO™ 肺类器官分支培养基 (SCM307) 更换培养基。在37 °C下孵育24小时。

12.第7天：用每孔2 mL的3dGRO™ 肺类器官分支培养基 (SCM307) 更换培养基。在37 °C下孵育24小时。

13.第8天：AFE细胞应表现出形态变化，由细胞簇/聚集体散布组成汇合区域。按照方案将进一步分化为成熟的肺类器官。多余的AFE细胞可以使用3dGRO™ 类器官冷冻培养基 (SCM301) 以每瓶3-6x10⁶ 个细胞进行冷冻保存。

图2.前肠内胚层(AFE)标记表达。大约95-100%的AFE细胞对Sox2（A、C、AB5603A4）和Pax9（B、C）呈双阳性。大约20-30%的AFE 细胞对EpCAM（D、F、MAB4444）和Pax9（E、F）呈双阳性。

第3步：将AFE细胞分化为肺芽类器官（第8-25天）

注意：在定型内胚层细胞的第4天和分化为前肠内胚层 (AFE) 细胞后的第8天，应观察到细胞密度高。下面的方案提供了6孔板型的参考接种密度。调整其他板型的接种密度。

1.将1 mL新鲜的3dGRO™ 肺类器官分支培养基(SCM307) 吸出并添加到包含AFE细胞汇合层的6孔板的每个孔中。

2. 使用5 mL移液器，沿每个孔的表面轻轻刮擦，将细胞单层聚集并提取。小心不要研磨成单细胞。将细胞聚集体从6孔板的1孔转移到Costar® 超低附着24孔板 (CLS3473) 的孔中。

3. 加入0.5 mL 3dGRO™ 肺类器官分支培养基 (SCM307) 以收集所有剩余细胞并添加到低附着24孔板的细胞孔中。总体积=~1.5 mL细胞悬浮液。在37°C下孵育。

4. 每隔一天更换一次培养基，直到第20-25天。由于类器官处于浮动培养中，因此请根据方案进行培养基更换：

1) 使用1 mL玻璃血清移液器将漂浮的类器官转移到无菌的15 mL锥形管中。等待10分钟，使类器官沉淀到试管底部。

2) 将2mL吸液管连接真空泵。在2mL吸气移液器上，连接一个无菌的20 μL非屏障移液器尖头。小心地吸出培养基。注意在类器官上方留下少量培养基作为缓冲液，以避免干扰类器官。

3)将0.5 mL 3dGROTm 肺类器官分支培养基 (SCM307)添加到含有类器官颗粒的15 mL管中。用1 mL玻璃移液器上下移液两次。将类器官转移回超低附着24孔板中的同一孔中。

4)将0.5mL3dGRO"肺类器官分支培养基SCM307)添加到15 mL形管中，冲洗并收集所有剩余的类器官。将冲洗液添加到超低附着24孔板的同一孔中。总体积=每孔1 mL。

图3.悬浮培养的人肺芽类器官（LBO）。分化第23天未成熟人iPS细胞衍生LBO的形态学。下图显示了具有折叠结构（箭头）的最佳类器官，可以选择这些类器官在使用3dGRO™肺类器官成熟培养基（步骤4）的ECM凝胶（或默克ECM水凝胶E6909）夹层中进一步成熟。

第4步：将肺芽类器官(LBO)分化为成熟的肺类器官（第 25-60天）

在冰上解冻含减生长因子ECM凝胶基质。

2. 使用无菌镊子将无菌24孔细胞培养小室放到未经组织培养处理的24孔板中，每孔使用一个插件。

3. 将50 µL冷的含100%减生长因子ECM凝胶基质分装到每个细胞培养小室中。等待5分钟，让ECM凝胶基质固化。

4. 同时，将一孔浮肺芽类器官 (LBO) 转移到60 mm培养皿中。在单独的96孔U型底板中，向每个孔中加入60 µL 3dGRO™ 肺类器官成熟培养基 (SCM308)。

注意：培养至20-25天，会有许多漂浮的肺类器官（图 12）。每个ECM凝胶夹层应包含大约4-6个类器官。根据您计划制作的ECM凝胶夹层的数量，计算96孔板中制备类器官/ECM凝胶悬浮液所需的孔总数。

5. 在无菌解剖罩中，使用体积设置为10 µL的无菌20 µL移液器吸头从60 mm培养皿中选择6个折叠的类器官，并将其转移到96孔U型底板的1个孔中。

6. 将96孔板从解剖罩转移到组织培养罩中。

注意：为避免ECM凝胶基质过早凝胶化，我们建议一次制备不超过3个细胞培养小室。

1) 将60 µL冷的100%减生长因子(GFR)ECM凝胶基质加入步骤5中的96孔板的每个孔中。通过移液器轻轻混合几次，避免产生任何气泡。总体积=每孔130 µL。

2) 立即将类器官-GFR ECM凝胶基质混合物 (~130 µL) 转移到步骤3中制备的24孔板上每个细胞培养小室的中心。

3) 等待5分钟，让ECM凝胶基质固化。

4) 重复以上步骤完成6个夹层的处理。

7.将75 L冷的100%减生长因子(GFR) ECM凝胶基质添加到细胞培养小室顶部，形成ECM凝胶夹层。将24孔板放入37°C的培养箱中至少30分钟，以确保ECM凝胶夹层已固化。如果要嵌入的夹层超过6个，请重复步骤4-7。

8.在每个插件顶部添加500 L 3dGROm 肺类器官成熟培养基(SCM308)，并在细胞培养小室下方的孔中加入 500 L。

9.每隔一天更换一次培养基。

1)将2mL吸液管连接到真空泵上。在2mL吸气移液器上连接一个无菌的20 L非屏障移液器尖头。小心吸出ECM凝胶夹层顶部和细胞培养小室下方的培养基。

2) 在每个细胞培养小室顶部和下方的孔中各加入500 L3dGRO^TM 肺类器官成熟培养基(SCM308)。

图4.肺类器官成熟的时间过程。在两个单独的孔中追踪人iPS细胞衍生的肺类器官分化。在第20-25天，使用3dGRO™ 肺类器官成熟培养基将大约4-6个未成熟LBO嵌入到ECM凝胶基质中。观察到各种形态，包括在尖端的分支结构和/或圆形扩张，在中心有类似于肺泡球的致密组织。当持续培养超过60-70天时，一些大的圆形结构可能会破裂，释放出粘液样物质。

图5. 肺类器官标记表达。来自人外周血单核细胞 (PBMC) 和HFF人iPS细胞的成熟肺类器官在第70天表达产生肺表面活性蛋白的II型肺泡上皮细胞 (SFTPC 和 SFTPB)、气道杯状细胞 (Muc5AC)、肺内胚层(EPCAM、Sox9,NKX2.1) 和纤毛细胞 (Acetyl-α-Tubulin) 的标志物。细胞核使用DAPI复染。

图6.肺类器官可用于研究SARS-CoV-2呼吸道病毒感染。肺芽类器官表达ACE2、SARS-CoV-2结合受体(A)和丝氨酸蛋白酶 TMPRSS2 (B)，可增加SARS-CoV-2病毒入侵。