【Merck】人iPS细胞分化为结肠类器官

类器官是一种复杂的自组织3D细胞培养模型，通常源自于干细胞。类器官已报道可由多种组织产生，包括脑、肠、胃、结肠、肝脏、胰腺、肺、肾脏和患者来源的肿瘤。上皮肠类器官，通常称为肠样或小肠，可维持胃肠系统的生理特征，并且已成为模拟肠道发育和疾病(包括结肠癌、乳糜泻、炎症性肠病和宿主微生物组相互作用)的一种有用细胞培养工具。Clevers等人开发的传统分离技术依赖于耗时的原发组织分离，其中包括从小鼠或难以获取的人体组织样本中进行分离。诱导多能干细胞衍生的类器官将能够从更广泛的人类供体中快速生成患者特异性细胞模型。目前，我们已经生成了一个人类PSC衍生的结肠类器官系统，该系统包含高度表征、可直接进行分析的冻存人类结肠类器官以及扩增培养基。此外，我们优化的无血清培养基和试剂可用干通过简单的三步分化过程从任何人类iPS细胞系中分化结肠类器官。

图 1.人类结肠类器官分化流程。人类结肠类器官可以通过定形内胚层、后肠内胚层和结肠类器官扩增阶段，使用三步分化方案从人类IPS细胞生成。

第1步：人类iPS细胞分化为定形内胚层（第0-4天）

注意：其实材料为高品质未分化的人类ES/iPS细胞(SCC271)（细胞融合度约为70-80%，且含有<5%的分化细胞）。以下方案用于分化六孔组织培养处理孔板中的单孔。文中所指的体积均为针对单孔体积。请根据需要调整体积。

① 准备单细胞传代培养基。将ROCK抑制剂(ROCKi) Y-27632(SCM075)添加到7-10 mL人类ES/iPS扩增培养基(SCM130)中，终浓度为10 μM。

②用ECM GEL(CC131-5ML)涂覆6孔板。

③吸出培养基。用2 mL的DMEM/F12或1XPBS清洗孔。吸出1 mL Accumax™ (A7089)并将其添加至孔中。在 37°C下孵育5-6分钟。用手掌敲击孔板，以帮助解离细胞。

④向孔中加入1 mL单细胞传代培养基（来自步骤 1）。用 5mL移液管上下吹打1-3次，以解离细胞。小心不要引入任何气泡。

⑤ 将解离的细胞收集在15 mL锥形管中。将1 mL单细胞传代培养基添加至孔中，收集剩余残留的细胞，并转移至含有细胞悬浮液的15 mL锥形管中。以140xg离心5分钟并吸出上清液。

⑥ 将细胞沉淀重悬于1 mL单细胞传代培养基中。使用台盼蓝(T8154和血细胞计数板计算活细胞总数）。

⑦将每孔1x10⁶个细胞加入ECM Gel (CC131-5ML)涂覆的6孔板中。使用的培养基为单细胞传代培养基（从步骤 1 开始）；总体积=每孔3 mL。37°C孵育过夜。

⑧从孔中吸出培养基。将2mL的定形内胚层诱导培养基(SCM302)添加至孔中，并37°C孵育过夜。

⑨在第2天和第3天重复第8步。在第4天通过流式细胞术分析细胞。在进行接下来步骤2之前，细胞的内胚层标志物CXCR4、c-Kit、Sox-17和FOXA2的阳性率应 >85%，PDGFR 为阴性。

图2.人iPS细胞的内胚层分化。对人iPSC分化的定形内胚层细胞的内胚层标志物进行流式细胞分析表明，分化四天后，细胞为CXCR4+、c-Kit+、Sox-17+、PDGFR-和FOXA2+。

第2步: 后肠内胚层分化 (第4-8 天)

①从培养箱中取出含有第4天定形内胚层培养物的6孔板

②从每个孔,中吸出培养基。

③用3 mL1X PBS 清洗每个孔。

④在每个孔中加入2mL预热的后肠诱导培养基(SCM303)。

⑤立即将板转移到37°C ，5% CO₂培养箱中育24小时。

⑥重复步骤2-5，共5天。

⑦后肠内胚层分化的第5天是确定CDX2表达的关键时间点。CDX2的表达必须>60%才能进行步骤3。如果 CDX2的表达低于60%，则再进行一天HE分化并重新检查CDX2的表达。

图 3. 定形内胚层细胞分化为后肠内胚层细胞。后肠内胚层诱导后A) 第2 天 B) 第 3 天和 C) 第 4 天后肠内胚层细胞的形态。

第3步：结肠类器官的扩增和冷冻保存（第8-48天）

结肠类器官的扩增

1. 从培养箱中取出含有第8天后肠内胚层培养物的6孔板。

2. 从每个孔中吸出培养基。

3. 用3 mL 1X PBS清洗每个孔。

4. 将2 mL预热的3dGRO™ 人类结肠类器官扩增培养基(SCM304)添加到每个孔中。

5. 立即将板转移到37°C ，5% CO₂培养箱中培养48小时。

6. 每2天用3dGRO™人结肠类器官扩增培养基 (SCM304) 更换培养基，直到分化第12天。

 注：结肠球状体将在第12天结束时形成，在3dGRO™ 人类结肠类器官扩增培养基(SCM304)中，其将嵌入ECM凝胶基质中以生成成熟的结肠类器官。

7. 将终浓度为10 µM的 ROCKi Y-27632 (SCM075)添加到人结肠类器官扩增培养基(SCM304)中。

8. 4 °C过夜或在冰上解冻足量的减生长因子ECM凝胶。

9. 在结肠上皮细胞分化的第12天， 从培养箱中取出细胞并将漂浮在培养基中的球状体收集到15 mL锥形管中。

10.用3 mL 1X PBS清洗每个孔。

11.用1 mL Accumax (A7089)分离含有球状体（非悬浮球状体）的单层，并37 °C孵育5-10分钟。

12.解离单层后，用P-1000移液器轻轻移取细胞4-5次，然后将1mL细胞悬液转移到上述步骤9中制备的锥形管中。

13.4 °C下265 x g离心5分钟。

14.吸出上清液并用4 mL 1X PBS洗涤一次。

15.4 °C下265 x g离心5分钟并吸出上清液。

16.轻弹锥形管的底部，使沉淀物脱落。

17.将基质胶置于细胞培养超净台中，快速取出1 mL并将其添加到步骤16中脱落的细胞沉淀中。

18.用设置为900 µL的P-1000移液管在ECM凝胶基质中轻轻重悬细胞沉淀。避免在在悬浮过程中引入气泡。

19.立即将细胞悬液置于冰上5分钟以防止凝胶化。

20.在新鲜的基质胶中以1:50-1:100稀释1mL基质胶/细胞悬液，并在24孔板的每个孔中接种50µL/孔（例如：对于1:100稀释， 将步骤18中的10 µL基质/细胞悬液与 40 µL新鲜基质混合。接种50 µL/孔）。见下图7。

21.立即将24孔板37 °C孵育10分钟。

22.待液滴凝胶化后，加入 1 mL 3dGRO™ 人结肠类器官扩增培养基 (SCM304) + 10 µM ROCKi (SCM075)。

23.可以每两天使用1 mL新鲜的 3dGRO™ 人结肠类器官扩增培养基 (SCM304) 更新培养基。

24.可每10-12天以1:3至1:4的比例，使用3dGRO™ 类器官解离试剂 (SCM300)对类器官进行传代。

图 4. 人类结肠类器官。A) 解冻后两天，结肠类器官封装在基质胶圆滴中。B) 培养至第 10-12 天，结肠类器官占据 85-90% 的圆滴，并进行传代。

结肠类器官的冷冻保存

人结肠类器官可以使用3dGRO™ 类器官冷冻培养基(SCM301)进行冷冻保存。该实验方案针对传代过程中不使用任何解离试剂的人结肠类器官进行冷冻保存。建议圆滴的起始数量为每管四个（假设每个圆滴的密度为90%）。如果密度低于90%，则每管可冷冻更多圆滴。

1. 当类器官准备好传代进行冷冻保存时，将板从培养箱中取出。

2. 用P-1000移液器上下吹打5次，将每个ECM凝胶基质圆滴重新悬浮在其现有的1 mL培养基中。

3. 将类器官悬浮液转移至锥形管中。

4. 用10 mL移液器沿锥形管壁侧移液10次，继续分散类器官。

5. 以265 x g至700 x g离心锥形管。

6. 吸出上清液并用1 mL 1X PBS重悬沉淀。

7. 继续用P-1000移液器上下吹打20次以分散类器官颗粒。

8. 向类器官悬浮液中加入5 mL 1X PBS，并在4 °C下以 700 x g离心5分钟。如果上清液中存在残留的类器官碎片，则再离心5分钟。

9. 吸出上清液并用1 mL 3dGRO™类器官冷冻培养基 (SCM301) 重悬沉淀。

10. 用P-1000移液器重悬沉淀5次，加入冷冻培养基以获得四个圆滴每毫升每管。

11. 将冷冻保存管中的细胞转移到冷冻容器（例如Mr. Frosty）中，然后放入-80 °C冰箱中24-72小时。

12.将冷冻保存的人结肠类器官转移至液氮罐中长期储存。

图5.人iPS细胞衍生的结肠类器官的形态。成熟的人结肠类器官在三维培养时具有复杂的形态。A) 4X放大倍数 B) 10X 放大倍数。

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