【Merck】3D细胞培养技术——HyStem® 天然仿生水凝胶
原理简介
HyStem细胞培养支架是首个可定制的合成ECM，与体内条件非常相近。使用HyStem平台，研究人员可控制生长因子、黏附因子和ECM蛋白的掺入、水凝胶硬度及细胞囊化等。由于HyStem是一种合成的基质，而不是生物提取物，所以研究人员能够密切控制细胞环境的组成。
HyStem的成分包括化学合成的HyStem（巯基化透明质酸）、Extralink™（硫醇反应性交联剂）、脱气的水和生物纯化的Gelin-S™（变性胶）。干细胞的天然环境富含透明质酸，因此，HyStem试剂盒是培养干细胞的最佳选择。HyStem水凝胶支架精密模仿了天然的细胞外基质环境，含有丰富的透明质酸和胶原纤维，同时具有定制灵活性，能加入适当的生长因子、附着因子和蛋白。水凝胶基质还为3D干细胞生长提供了基本支架。干细胞可以在交联过程中被包裹，在水凝胶中附着并生长。水凝胶硬度可根据天然组织的硬度调整。
操作指南
HyStem® 细胞培养水凝胶支架制备方案
1、试剂耗材准备
HyStem® 细胞培养支架试剂盒（货号：HYS020）
注意：由于材料会在氧气存在下发生交联，请勿打开 HyStem S 瓶盖。使用注射器和针头添加脱气水。
制备 1× 储备溶液：
▪ HyStem–向瓶中加入1ml脱气水复溶（货号 W3894，试剂盒自带）
▪ Extralink 1–向瓶中加入0.5ml脱气水复溶(货号 W3894，试剂盒自带）
1× Extralink 1储备溶液可在–20 °C下保存约1个月。
1× 储备溶液含 1× 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH ~7.4。
2、实验步骤
1×储备溶液在15–37°C时保持液态。将交联剂Extralink 添加到HyStem（硫醇修饰的透明质酸）中时，会形成水凝胶。溶液混合后20分钟内发生凝胶化。无需采取步骤保持低温或低pH。
可通过改变交联用1×Extralink 1储备溶液体积，或使用PBS或细胞培养基稀释1×HyStem储备溶液，改变水凝胶刚性。用PBS或细胞培养基稀释1×HyStem储备溶液可以增加胶凝时间。标准HyStem水凝胶的刚度约为300 Pa。
以下是制备2.5 ml批次水凝胶支架的操作步骤。随附剂量足够制备3批 (7.5 ml) 水凝胶。
①等待HyStem（2 瓶）、Extralink 1（1 瓶）和脱气水瓶达到室温。
② 在无菌条件下，使用注射器和针头，向每个HyStem瓶中加入1.0 ml脱气水(货号W3894)(参见制备说明）。
③将瓶子水平放置在摇床或振荡器上。固体完全溶解需要<30分钟。升温至≤37 °C 和/或轻轻涡旋可加速溶解。1×储备溶液透明且略带粘性。
④ 在无菌条件下，使用注射器和针头，向Extralink 1瓶中加入0.5 ml 脱气水（货号W3894）。颠倒几次以溶解。
⑤ 将2瓶1× HyStem储备溶液混合在一起。使用移液器缓慢来回移液进行溶解，避免产生气泡。
⑥如果需添加ECM蛋白，将无菌ECM蛋白溶液添加到HyStem 1×储备溶液中。用移液器来回吹打混合。
⑦如果需包裹细胞，将细胞沉淀重悬于HyStem 1×储备溶液中。用移液器来回吹打混合。
⑧将以下溶液进行吹打混合，以形成水凝胶：
0.5 ml 1× Extralink 1储备溶液
2.0 ml 1× HyStem储备溶液
⑨胶凝将在<20分钟内发生。
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