【Merck】3D细胞培养技术——TrueGel3D 合成水凝胶
原理简介
合成水凝胶可提高可控性，减少动物来源水凝胶常见的批次间差异性、污染和生物兼容性干扰问题。
TrueGel3D™ 合成水凝胶不含任何可能干扰或污染实验的动物来源产品。
TrueGel3D™合成水凝胶系统包括四种成分，聚合物、交联剂、细胞相互作用成分和细胞混合。这些成分可保持活力并模拟天然ECM重要特性。与传统2D细胞培养条件相比，水凝胶包被的3D培养细胞更接近天然组织的细胞环境，促进细胞粘附和迁移。TrueGel3D™合成水凝胶技术能提供相关机械和生化信息，有助于研究3D环境细胞形态和生理特性。
TrueGel3D™合成水凝胶3D培养的优势：
•兼容多种类型细胞（MDCK、上皮、成纤维细胞、癌症细胞以及包括淋巴细胞、基质和胚胎心肌细胞在内的原代细胞）
• 凝胶硬度易于调节
• 可增强细胞成像能力的透明度
• TrueGel3D™试剂盒针对不同应用提供了不同凝胶成型速度选择
• 提供无毒性细胞回收方案的水凝胶形式
• 无动物源的明确成分，支持一致性性能
操作指南
一、 TrueGel3D™ 水凝胶细胞可降解（CD）交联剂和RGD肽(TRUE1）制备方案
TrueGel3D™是由聚合物和交联剂交联而成的化学成分明确的水凝胶。这种水凝胶可以包裹细胞使其在三维环境中生长，更加贴切地模拟天然组织环境。
TrueGel3D质标准的3D™水凝胶：
●适中密度提供适合冬种细胞的生长环境
●预定浓度的RGD适合细胞粘附
●CD (细胞可降解) 交联剂让细胞可以在水凝胶内自由地铺展和迁移
●3D培养实验完成后可采用TrueGel3D™ 酶促细胞回收液回收细胞，以便用于下游分析
当3D水凝胶实验方案的最佳应用条件尚未确定，或者凝胶硬度无需优化时，可选择TRUE1 (TrueGel3D™ 水凝胶CD交联剂和RGD肚) 作为起步配置
1、试剂耗材准备
TrueGel3D水凝胶试剂盒（货号：TRUE1-1KT）
▲RGD可降解聚合物
注意:-70°C储存时，请在每次临使用前将RGD可降解聚合物预热至室温
●用860 uL缓冲液在试管中重悬(RGD可降解聚合物)
●涡旋直至所有材料溶解
●将重悬后的聚合物在室温下孵育1小时
●短暂离心;RGD可降解聚合物制备好后可直接使用
▲CD细胞可降解交联剂
●获得含20 mM硫醇基团的交联剂
●涡旋直至所有材料溶解
●在室温下孵育5分钟
●涡旋并离心
●CD交联剂制备好后可直接使用
为尽量减少巯基氧化，非必要时，勿将CD交联剂暴露于空气和室温。每次使用后务必迅速盖上试剂盖。重悬液可–20°C或–80°C储存。
短期储存（<1个月）时，RGD可降解聚合物和重悬液均可4°C储存。
2、实验步骤
①用培养基、PBS或其他生物缓冲液制备细胞悬液。
②在反应管中，将RGD可降解聚合物加到细胞悬液中，温和混匀。将CD交联剂加到混合液中，温和地上下吹吸数次混匀。各组分的体积比如表1所示。
表1. 凝胶组分体积
成分 | 不同最终凝胶体积下的试剂体积，µL | ||
RGD可降解聚合物 | 18 | 36 | 72 |
CD交联剂 | 2 | 4 | 8 |
细胞悬液 | 5 | 10 | 20 |
凝胶总体积 | 25 | 50 | 100 |
③凝固前将混合液接种到合适的培养血*中。
注意:混合液在开始凝固前会保持1-4分钟的液体形态:务必在这段时间内加好全部混合液。
*可使用多孔板(6、24或96孔》或任意的无菌培养板或培养瓶。推荐使用未经组织培养处理的聚苯乙烯。如需细胞成像，建议采用带细胞培养腔室的载玻片，比如Millicell® EZ SLIDE 8孔无菌腔室载玻片 (货号PEZGSO816)
④混合液37°C孵育20分钟。也可以室温孵育，但凝固所需时间更久。
⑤吸头轻触凝胶，检查凝胶是否形成。收回吸头后，吸头表面没有凝胶线代表成胶。
⑥加入充足的培养基覆盖凝胶。
⑦培养血或培养瓶盖上盖子，在培养箱中培养。
⑧培养1小时后，更换培养基 (换液)。
⑨根据细胞正常生长的需要更换培养基。
二、 TrueGel3D™ 酶促细胞回收液回收细胞
使用TrueGel3D酶促细胞回收溶液可溶解葡聚糖骨架的水凝胶基质（TRUE1/2/3/6/7）。
1、试剂耗材准备
TrueGel3D 酶促细胞回收液（货号：TRUEENZ）
2、实验步骤
①.加入300 uL 1:20稀释的TrueGel3D酶促细胞回收溶液，溶解25 uL凝胶。
注意:凝胶切成小块会加快溶解速率
②37°C孵育30-60分钟。
③离心细胞悬液并在新鲜培养基或缓冲液中重悬沉淀的细胞。
④重复步骤 3 两次，从凝胶成分中清洗残留的TrueGel3D 酶促细胞回收溶液。
⑤现可利用细胞进行培养后分析或制备新水凝胶。
注意: 如果TrueGel3D酶促细胞回收溶液没有完全去除，会破坏新制备的水凝胶
三、TrueGel3D™快速水凝胶制备方案(TRUE1/2/3/4）
TrueGel3D™ 是由聚合物和交联剂混合而成的化学成分明确的水凝胶。这种水凝胶可以包裹细胞使其在三维环境中生长，更加贴切地模拟天然组织环境。
TrueGel3D™ 中的聚合物分为两种：聚乙烯醇(PVA)和葡聚糖，前者是人工合成的不可降解聚合物，后者可通过TrueGel3D™酶促细胞回收液降解。两种聚合物都经快速或慢速巯基(SH)反应性基团官能化。
快速巯基反应性基团包括聚合物骨架中的马来酰亚胺基，它与交联剂快速反应形成水凝胶，根据所用凝胶成分和pH的不同在数秒到数分钟内不等。
1、试剂耗材准备
产品编号 | 说明 |
TRUECD | TrueGel3D Crosslinker CD cell-degradable crosslinker |
TRUEPEG | TrueGel3D Crosslinker PEG non cell-degradable crosslinker |
TRUEENZ | TrueGel3D酶促细胞回收液 solution, 500 μl |
TRUE1 | TrueGel3D水凝胶试剂盒 CD cell-degradable crosslinker and RGD peptide |
TRUE2 | TrueGel3D水凝胶试剂盒 FAST-DEXTRAN, allow cell recovery, PEG non cell-degradable crosslinker |
TRUE3 | TrueGel3D水凝胶试剂盒 FAST-DEXTRAN, allow cell recovery, CD cell-degradable crosslinker |
TRUE4 | TrueGel3D水凝胶试剂盒 FAST-PVA, CD cell-degradable crosslinker |
TRUERGD | TrueGel3D RGD Integrin Adhesion Peptide |
TRUESRGD | TrueGel3D Scramble RGD Integrin Adhesion Peptide |
按照产品说明书准备试剂。
TrueGel3D™ 缓冲液务必要充分溶解。不能用冰冷却缓冲液，不然会导致缓冲盐结晶。
为了尽量减少巯基氧化，非必要时，勿将RGD整合素粘附肽、PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂暴露于空气和室温。每次使用后务必迅速盖回试剂盖。
采用培养基、PBS或生理溶液配制储备用细胞悬液或其他生物样本。
2、实验步骤
水凝胶混合液制备注意事项：
使用TrueGel3D™ 水凝胶快速构建试剂盒时，可以修改和优化不同参数。表2提供了使用或不使用TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽或蛋白制备软水凝胶的试剂体积。
表2. 使用或不使用TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽或蛋白快速构建软水凝胶的试剂体积
试剂 | 试剂体积(µL) | ||
- | 无TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽 | 有TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽 | 有蛋白质（推荐浓度：200 µg/ml） |
巯基反应性聚合物（FAST-PVA或FAST-DEXTRAN） | 2 | 2.5 | 4 |
交联剂（PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂） | 3 | 3 | 6 |
细胞悬液 | 6 | 6 | 6 |
TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽 | - | 0.8 | - |
蛋白质(200 µg/ml) | - | - | 4.5 |
TrueGel3D™缓冲液 pH 5.5 | 2.4 | 2.4 | 2.4 |
水 | 16.6 | 15.3 | 7.1 |
总体积 | 30 | 30 | 30 |
①在反应管中加入水、TrueGel3D™ 缓冲液(pH 5.5)和FAST巯基反应性聚合物（FAST-PVA或FAST-DEXTRAN）。
②（如果不需要加入TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽，跳至步骤3）。加入TrueGel3D™ 整合素粘附肽，立即混匀，确保FAST巯基反应性聚合物与多肽均匀反应。样品孵育20min，使RGD肽连接到聚合物的马来酰亚胺基上。
③将交联剂（PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂）加到无菌培养皿*表面。交联剂不要铺开，要保持单滴的液滴形式。
*可使用多孔板(6、24或96孔)或适用的无菌培养板或培养瓶。推荐使用未经组织培养处理的聚苯乙烯。如需细胞成像，建议使用带细胞培养腔室的载玻片，比如Millicell® EZ SLIDE 8孔无菌腔室载玻片（货号PEZGS0816）
④ 在含有水、缓冲液、FAST巯基反应性聚合物和TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽（如适用）的反应管中加入细胞悬液和蛋白质（如适用）。
⑤吸取27 μL混合液（如未加蛋白质）或24 μL混合液（如加入蛋白质），加到预加交联剂的细胞培养皿中，上下吹吸三次快速混匀，小心防止气泡形成。静置。约等3分钟，凝胶形成。
⑥将足够覆盖凝胶的细胞培养基加入细胞培养皿。
⑦培养皿放到组织培养箱中培养。
⑧培养1小时后，更换培养基（换液）。
⑨细胞培养期间按照要求换液。
注意：TrueGel3D™ 水凝胶的化学性质决定了混匀数秒后就会开始形成凝胶。因此，要尽可能快速地进行混匀操作，避免吸头中有凝胶形成。加入细胞培养基之前，可用吸头轻触凝胶，检查是否成胶。
可用TrueGel3D™ 酶促细胞回收液溶解TrueGel3D™ FAST-DEXTRAN水凝胶，具体操作步骤请参考“TrueGel3D™ 酶促细胞回收液回收细胞
3、凝胶多样化制备的细节变动
制备小体积凝胶：
如果制备的是小体积凝胶（小于100 μL），只需使用极少量的TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽储液。建议用水稀释TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽储液（从20 mmol/L降到3 mmol/L），使移液更加便利。如果稀释了粘附肽储液，相应地必须减少混合液中的水量，以保持最终体积不变。
同时制备多块相同凝胶：
制备相同成分的多块凝胶时，可将水、TrueGel3D™ 缓冲液、巯基反应性聚合物（SLO-PVA或SLO-DEXTRAN）、TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽（如适用）、细胞悬液和交联剂的最终混合液放大为单份预混液，再进行分装。分装前充分混匀，确保每块凝胶的用量相等。
制备不含细胞的普通凝胶或包埋其他标本：
如果凝胶中不含细胞，比如用于组织包埋或制备普通凝胶，将配比方案中规定的细胞悬液用量替换成细胞培养基、PBS或其他任意的生理相容性溶液（自行选择）。
替换TrueGel3D RGD整合素粘附肽制备实验对照：
TrueGel3D™ 硫代甘油可替代TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽加到凝胶中。这样构建的凝胶不含细胞粘附位点，可作为RGD肽改性凝胶的对照。TrueGel3D™ 随机RGD整合素粘附肽（货TRUESRGD-1EA和TRUESRGD-3EA)也可用于对照实验。
四、TrueGel3D™ 慢速水凝胶制备方案(TRUE6/7/8/9）
TrueGel3D™是由聚合物和交联剂混合而成的化学成分明确的水凝胶。这种水凝胶可以包裹细胞使其在三维环境中生长，更加贴切地模拟天然组织环境。
TrueGel3D™ 中的聚合物分为两种：聚乙烯醇(PVA)和葡聚糖，前者是人工合成的不可降解聚合物，后者可通过TrueGel3D™酶促细胞回收液降解。两种聚合物都经快速或慢速巯基(thiol)反应性基团官能化。
慢速胶凝聚合物SLO-PVA和SLO-DEXTRAN可以缓慢的胶凝速度构建水凝胶，适合用于微通道或注射器填充之类的应用。形成固体水凝胶所需孵育时间为8到50分钟，具体取决于所选聚合物和交联剂（CD细胞可降解交联剂或PEG细胞不可降解交联剂）。
1、试剂耗材准备
产品编号 | 说明 |
TRUECD | TrueGel3D Crosslinker CD cell-degradable crosslinker |
TRUEPEG | TrueGel3D Crosslinker PEG non cell-degradable crosslinker |
TRUEENZ | TrueGel3D 酶促细胞回收液 solution, 500 μl |
TRUE6 | TrueGel3D 水凝胶试剂盒 SLO-DEXTRAN, allow cell recovery, PEG non cell-degradable crosslinker |
TRUE7 | TrueGel3D 水凝胶试剂盒 SLO-DEXTRAN, allow cell recovery, CD cell-degradable crosslinker |
TRUE8 | TrueGel3D 水凝胶试剂盒 SLO-PVA, CD cell-degradable crosslinker |
TRUE9 | TrueGel3D 水凝胶试剂盒 SLO-PVA, PEG non cell-degradable crosslinker |
TRUERGD | TrueGel3D RGD Integrin Adhesion Peptide |
TRUESRGD | TrueGel3D Scramble RGD Integrin Adhesion Peptide |
TRUETHIO | TrueGel3D Thioglycerol Solution solution, 180 μl |
按照产品说明书准备试剂。
TrueGel3D™缓冲液务必要充分溶解。不要用冰冷却缓冲液，不然会导致缓冲盐结晶。
为了尽量减少巯基氧化，非必要时，勿将RGD整合素粘附肽、PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂暴露于空气和室温。每次使用后务必迅速盖回试剂盖。
2、实验步骤
水凝胶混合液制备注意事项：
使用TrueGel3D™ 水凝胶慢速构建试剂盒时，可以修改和优化不同参数。表3提供了使用或不使用TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽或蛋白制备软水凝胶的标准配比方案。
表3. 使用或不使用TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽或蛋白慢速构建软水凝胶所需试剂体积
试剂 | 试剂体积(µL) | ||
- | 无TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽 | 有TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽 | 有蛋白质（推荐浓度：200 µg/ml） |
巯基反应性聚合物（SLO-PVA 或SLO-DEXTRAN） | 2 | 2.5 | 4 |
交联剂（PEG细胞不可降解交联剂或CD细胞可降解交联剂） | 3 | 3 | 6 |
细胞悬液 | 6 | 6 | 6 |
TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽 | - | 0.8 | - |
蛋白质(200 µg/ml) | - | - | 4.5 |
TrueGel3D™缓冲液 pH 7.2 | 2.4 | 2.4 | 2.4 |
水 | 16.6 | 15.3 | 7.1 |
总体积 | 30 | 30 | 30 |
① 在反应管中加入水、TrueGel3D™ 缓冲液(pH 7.2)和SLO巯基反应性聚合物（SLO-PVA或SLO-DEXTRAN）。充分混匀。
②（如果不需要加入TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽，跳至步骤3）。加入TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽，立即混匀。样品孵育20 min，使RGD肽连接到聚合物上。
③ 在含有水、缓冲液、SLO巯基反应性聚合物和TrueGel3D™RGD整合素粘附肽（如适用）的反应管中加入细胞悬液和蛋白质（如适用）。
根据需要在混合液中加入交联剂：根据所选交联剂选择相应的操作方案：
A- CD交联剂交联：混合液会在在1分钟内开始形成凝胶，并且变得不可抽吸。转入合适的细胞培养皿*之前，通过温和抽吸重悬细胞，确保细胞会悬浮在凝胶中。25 min后（加入细胞培养基之前），可用吸头轻触凝胶，检查是否成胶。
B-PEG细胞不可降解交联剂交联：混合液会持续液态10分钟之久，才会开始形成凝胶。开始成胶后，混合物就会变得不可抽吸。
可利用这段时间将混合液转入合适的无菌培养皿*中，不过在胶凝开始前，需要混合或搅动来重悬细胞，确保细胞会悬浮在凝胶中。完成胶凝约需50分钟孵育时间。加入细胞培养基之前，可用吸头轻触凝胶，检查是否成胶。
* 培养器皿可选择多孔板（6、24、96孔）或任意的无菌培养板或培养瓶。推荐使用未经组织培养处理的聚苯乙烯。如需细胞成像，建议采用带细胞培养腔室的载玻片，比如Millicell® EZ SLIDE 8孔无菌腔室载玻片（货号PEZGS0816）
④将足够覆盖凝胶的细胞培养基加入细胞培养皿。
⑤培养皿放到组织培养箱中培养。
⑥ 1小时后换液。
⑦细胞培养期间按照要求换液。
可用TrueGel3D™酶促细胞回收液溶解TrueGel3D™ SLO-DEXTRAN水凝胶，具体操作步骤请参考“TrueGel3D™ 酶促细胞回收液回收细胞"
3、凝胶多样化制备的细节变动
制备小体积凝胶：
如果制备的是小体积凝胶（小于100 μL），只需使用极少量的TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽储液。建议用水稀释TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽储液（从20 mmol/L降到3 mmol/L），使移液更加便利。如果稀释了粘附肽储液，相应地必须减少混合液中的水量，以保持最终体积不变。
同时制备多块相同凝胶：
制备相同成分的多块凝胶时，可将水、TrueGel3D™ 缓冲液、巯基反应性聚合物（SLO-PVA或SLO-DEXTRAN）、TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽（如适用）、细胞悬液和交联剂的最终混合液放大为单份预混液，再进行分装。分装前充分混匀，确保每块凝胶的用量相等。
制备不含细胞的普通凝胶或包埋其他标本：
如果凝胶中不含细胞，比如用于组织包埋或制备普通凝胶，将配比方案中规定的细胞悬液用量替换成细胞培养基、PBS或其他任意的生理相容性溶液（自行选择）。
替换TrueGel3D RGD整合素粘附肽制备实验对照：
TrueGel3D™ 硫代甘油可替代TrueGel3D™ RGD整合素粘附肽加到凝胶中。这样构建的凝胶不含细胞粘附位点，可作为RGD肽改性凝胶的对照。TrueGel3D™ 随机RGD整合素粘附肽（货TRUESRGD-1EA和TRUESRGD-3EA)也可用于对照实验。
五、高通量3D细胞培养方案(TRUE-HTS）
TrueGel3D™ HTS水凝胶板是一种即用型解决方案，使用全合成水凝胶，简单、自动化地轻松配制3D细胞培养基。96孔聚苯乙烯玻璃底板包含预制合成官能化PEG基水凝胶。这些创新水凝胶的交联密度在整个孔中逐渐增加。用户可直接接种细胞，无需任何水凝胶制备或封装步骤。接种后，这些细胞率先接触到几乎没有交联剂的水凝胶表面，因此将逐渐自发渗透到水凝胶中，并在几天内建立3D细胞培养环境。此外，这种全新改造的水凝胶表面还可帮助用户连续建立共培养系统，即在相同水凝胶中不同时间点接种不同细胞群。
使用TrueGel3D® HTS水凝胶板进行3D细胞培养，有以下优势：
• 无需水凝胶制备和铺板步骤，直接加细胞即可
•完全合成，成分已知
•方便顺序接种多种细胞
• 180 µm玻璃底板，适合成像
• 室温储存
1、试剂耗材准备
2、实验步骤
通用细胞接种和培养维持方案
注意：开始前，请确认水凝胶板状态良好。聚乙烯(PE) 袋必须完好无损，里面没有可见液体。袋内的水凝胶板也必须完好无损。
①使用无菌层工作台下的剪刀或手术刀打开PE袋。取出水凝胶板后，板的顶部仍然由聚丙烯(PP)胶贴密封，以使内容物始终保存在96个孔内。从玻璃底部开始，确认玻璃盖完好无损、凝胶看起来透明，并检查孔中是否有水。
预热测定板。使用前，确保将测定板置于室温下至少30分钟。
②备好细胞和培养基待用。
③拆下密封胶贴。小心地从测定板上撕下密封胶带。建议左手按住桌子上的测定板，右手从右上角开始到左下角缓慢将密封胶贴撕掉。由于移除胶贴施加的压力，可能会在孔口形成液体弯月面，但该弯月面会在几秒内消失。
④抽取存储缓冲液。将移液管吸头插入孔中，沿侧壁向下。将移液管吸头放在孔内塑料环上，小心抽取储存盐水缓冲液。感到小小的吸入阻力是正常的，轻轻抬起移液管吸头，液体就会被吸入。
注意：不要触碰凝胶或在凝胶上方抽吸，以免对其造成损坏。可以使用多通道移液管或泵（低吸力）加快进程。部分存储缓冲液残留在孔上是可以接受的，因为这是三羟甲基氨基甲烷缓冲液，不会对培养基孵育产生负面影响。尽量缩短步骤4和步骤5的操作时间，以降低凝胶变干的风险。
⑤添加细胞和培养基。向每个孔加入最多200 μL的细胞悬浮液。将测定板转移至培养箱。将细胞置于培养基，每隔2天更换一次培养液，采用步骤4和步骤5的移液技术，建立3D细胞培养环境。
注意：胰蛋白酶残留痕量活性会导致水凝胶分解。使用无血清培养基时，分离细胞后，务必使用胰蛋白酶抑制剂或灭活溶液（如大豆）抑制胰蛋白酶。理想的细胞接种密度取决于培养基类型和示值。为了更好控制培养基成分的浓度，可在添加细胞前使用培养基浸泡并冲洗水凝胶。
⑥连续接种细胞（可选）。在预定时间点，移出培养基，加入第二个细胞群至共培培养基（最大容积200Μl/孔）。保持培养直至测定结束。每隔一天更换一次培养基。
回收细胞用于传代和分析
①使用60 uL/孔胶原酶(1 mg/mL)在37°C环境下分解凝胶30分钟。
②收集细胞至1.5 mL的微量离心管。
③提取的细胞可用于FACS、RNA/DNA的提取或后续测定
注意:其他胶原酶或酶混合液可用于提取细胞 (例如，释放酶或胰蛋白酶)
固定和细胞染色
①取200 μL细胞培养液，并使用200 μL/孔 4%的多聚甲醛PBS固化。
②如需抗原封闭，在PBS中加入由5%驴血清和0.3% TritonX100组成的200 μL/孔封闭缓冲液（如需细胞渗透），并在室温下孵育2小时。
③加入200 μL/孔PBS并在室温下静置5分钟(无需摇晃)。弃去多余PBS并重复操作三次。
④ 在4°C条件下使用100-150 μL/孔的一抗溶液在封闭缓冲液中孵育过夜。
⑤重复步骤2
⑥在室温下使用100-150 μL/孔二抗溶液在封闭缓冲液中孵育2小时。
⑦重复步骤2
注意：对于细胞外基质(ECM)蛋白染色，建议固化前在细胞培养基中加入一抗并在培养箱中静置至少3小时。然后，按照固定和染色方案操作。
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