【Merck】免疫沉淀常见问题及解决方案

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Merck coIP IP FLAGIPT1

采用抗体-抗原沉淀(又叫免疫沉淀(IP))的方法将特异性蛋白从细胞或组织裂解液中分离出来。免疫沉淀是很有价值的研究工具，目的是研究某一特定蛋白的关键信息，包括：小规模蛋白纯化用于功能研究，N-端序列分析，蛋白-蛋白相互作用的研究，细胞或组织中蛋白相对丰度和分布的测定。免疫沉淀分析法的成功取决于两个主要因素：原始样品中抗原的丰度和抗体对该抗原的亲和力。

在开始免疫沉淀之前，确保特定的步骤有适当的实验对照。对照抗体在性质上尽可能与该特异性抗体类似。关于多克隆抗血清，理想的抗体阴性对照应是来自同一动物的免疫前血清。但是，在缺乏来自同一动物的免疫前血清时，从同一种类的不同动物获得的相等浓度的非免疫（正常）血清也能满足要求。

免疫沉淀法可以分为下述关键步骤：

●抗原标记（可选）

●样品制备（细胞裂解释放蛋白）

●形成抗体―抗原（免疫）复合物

●免疫复合物沉淀

●分析

成功的IP / coIP ⸺ 来自默克解决方案

DYKDDDDK仅为1kDa，虽然小却特异性极好，因此FLAG^®Tag成为最受欢迎的纯化/IP/coIP融合标签。

Sigma的FLAG^®免疫沉淀试剂盒（目录号FLAGIPT1）使用特异性极佳的anti-FLAG M2 亲和凝胶结合，继而采用竞争性FLAG肽洗脱，这一快速、高效的免疫沉淀获得的蛋白可用于检测蛋白大小、翻译后修饰及相互作用。

• Sigma提供的anti-FLAG^® M2 系列产品规格齐全，A2220琼脂糖、M8823磁珠、F4799洗脱肽是行业标杆产品。

Troubleshooting

免疫沉淀法的最常见难点是尝试降低本底蛋白的数量和类型，这些蛋白可能污染免疫复合物。本底问题可能由多种原因造成，这些来源可能是特异性或非特异性的。这里列出处理非特异性本底问题的一些建议：

问题1：本底较高
可能原因	解决方案
裂解产物中的蛋白污染	在加入一抗之前，采用蛋白A/G琼脂糖珠预纯化溶解产物。加入一定量的竞争蛋白，如BSA/明胶、丙酮粉末或脱脂奶粉。在加入一抗之前，在100000 x g下离心溶解产物30min（弃去片状沉淀物）。
抗体溶液中的污染物	在100000 x g下离心抗体30min（弃去片状沉淀物），必要时滴定检测。
免疫沉淀抗体是非特异性的	尝试使用不同的抗体。
洗涤时间不足	增加洗涤次数。每次洗涤10分钟。
抗体过多	降低一抗的浓度。
孵育时间过长	降低一抗的孵育时间。
二抗非特异性结合	尝试不同的二抗，必要时进行滴定检测。
蛋白A/G微珠引起本底	在Western免疫印迹分析过程中，仅采用蛋白A/G作为对照，不加入一抗，以确定本底带是由蛋白A/G微珠引起的还是裂解液单独引起的。

问题2：在Western免疫印迹分析中检测到多个条带
可能原因	解决方案
抗原可能由一个以上多糖链构成，或可能有其它相关多肽。	其它免疫共沉淀的蛋白在分析抗原相互作用时常常是有用的，不应将其视为问题。
同时洗脱的捕获抗体的重链或轻链会干扰靶蛋白检测。	采用交联IP（蛋白A/G的共价交联捕获抗体）,以避免抗体被同时洗脱。

问题3：检测到多个条带分子量低于预期
可能原因	解决方案
可能表明样品发生蛋白降解，可能是由于蛋白酶抑制剂混合物失效或未加入引起的。	通过加入新鲜的蛋白酶抑制剂，配制新的样本裂解液。此步骤可以使用蛋白酶抑制剂混合物（539134）。