【Cytiva】WB实验流程之胶片检测化学发光和放射自显影

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胶片检测化学发光

在做化学发光蛋白质免疫印迹实验时，可使用X射线胶片显影。X射线胶片提供高灵敏度和灵活的曝光时间，可以检测非常微弱的信号。然而，X射线胶片在定量分析时，具有局限性，因为如果在胶片上同时检测弱信号和强信号时，强信号会过饱和。与CCD拍照式成像仪的图像相比，胶片的线性动态范围明显更窄。通常在使用X射线胶片进行检测时，需要考虑的其他缺点包括需要处理产生的化学废物以及对暗室的要求。

在X光胶片显影后，如果需要计算机进一步分析或者出版，就必须创建数字化图像。这时可以通过灰度校正的透射扫描仪或拍照式成像仪来实现。

可用于蛋白质印迹检测的胶片产品，如Amersham Hyper.ECL(表1)

表1 GE推荐用于Western Blot分析中用于成像的胶片

胶片	检测范围
Amersham Hyperfilm ECL	化学发光
Amersham Hyperfilm MP	放射线

Amersham Hyperfilm ECL为低丰度蛋白质的检测提供极好的灵敏度，优良的条带分辨效果。由于有防静电层，该胶片是无伪影的，并且由于背景清晰，可以产生出版质量的图像。Amersham Hyperfilm ECL适合与发光液AmershamECL、Amersham ECL Prime和Amersham ECL Select一起使用，它可以在自动洗片机中处理，也可以使用常用的X射线胶片显影剂和定影手动处理。

放射自显影（Autoradiography）

由于成本和安全问题（在放射性环境中工作、大量废物处理等），在蛋白质免疫印迹实验中，使用放射自显影（QWBA）作为检测手段已大大减少。尽管有很多问题，但放射自显影是非常敏感的，并且因为它与GE提供的大多数扫描式激光成像仪兼容，所以在这里简要地讨论，使用X射线胶片或储能式荧光屏（磷屏）进行放射自显影检测。

X射线胶片的放射自显影

自从放射性同位素用于标记生物分子以来，胶片呈现放射自显影一直是一种检测选择。由于胶片对大多数放射性同位素的灵敏度偏低，通常将放射线转换为光来提高检出限。然而，这种增强的灵敏度方式会被胶片的分辨率降低以及非线性响应所抵消，因此会导致定量分析时数据偏差。

储能式磷屏的放射自显影

如果蛋白质印迹法需要很高的灵敏度，放射性同位素与储存磷光屏（也称成像板）结合使用是一个很好的选择。储存磷光屏是可重复使用的，并且不会因反复暴露在实验室放射性水平下而降解——除非您使用的是氚和氚屏。将样品与存储荧光屏接触（使用曝光盒保护其不受光照），放射性同位素的位置被捕捉到磷屏上，磷屏晶体被激发到高能状态，然后将磷屏放置在成像仪中，红色光源（如激光）使晶体变得不稳定，从高能态返回到基态，释放较短波长的光，该光可通过适当的滤光片和检测系统捕获。这个过程被称为光致发光（photostimulated luminescence ，PSL）。

检测方法和成像仪的兼容性

表2列出GE可以提供的检测试剂和推荐的成像方法。

表2GE提供的检测方法及其兼容的成像方式

检测方法	试剂	成像方法
化学发光	Amersham ECL Amersham ECL Prime Amersham ECL Select	胶片/CCD拍照 CCD拍照/胶片 CCD拍照/胶片
荧光	Amersham ECL Plex CyDye染料	激光扫描成像/CCD拍照① 激光扫描成像/CCD拍照①
白光显色	考染银染	CCD拍照 CCD拍照
同位素/放射线	放射自显影	激光扫描/胶片