【Cytiva】WB实验流程之数字化成像

在蛋白质免疫印迹流程中数据分析前的最后一步是捕获图像。

增强化学发光(ECL)原理是鲁米诺底物与辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体之间的酶促反应。在过氧化氢存在下，辣根过氧化物酶催化鲁米诺的氧化，该反应会发出微弱的光。然后，可以在X射线胶片上或通过电荷耦合器件(CCD)的成像仪上，实现数字化检测化学发光。

当使用荧光检测方法时，通常将荧光基团与一抗或二抗结合，商品化的荧光二抗较多。荧光基团通过特定波长的光激发后发射荧光，通过光电倍增管（PMT）或CCD等光电转换检测器，将荧光基团发射的荧光信号转换为电信号。

然后数字化的电信号，将用图像显示出来，并用于后期分析。

在蛋白质免疫印迹应用中，根据从样品发射的光的特性，通常使用基于CCD拍照或基于PMT逐点扫描，进行数字成像。在下面的部分中，我们将简要描述这些成像系统及其对捕获不同类型发射信号的适用性。

在蛋白质免疫印迹实验中，虽然荧光的方法已经成熟，但是化学发光目前仍然是最常用的检测方法。传统上，化学发光是用X射线胶片检测的，它提供了高灵敏度，但是线性动态范围很有限（≧10²，2 OD），所以更适于免疫印迹的定性分析，不适于定量分析。但是，基于CCD拍照的成像仪，既可以提供高灵敏度的检测限，又具有较宽的线性动态范围（≧10⁴，4 OD），使得能够进行更精确的定量。此外，拍照式成像仪获取的式数字化的图像，便于处理、归档和分析，并且不产生化学废物，因为没有胶卷，也不需要暗室。

如果成像器配备了适当的滤光片和激发光源，拍照式成像仪还可以用于获取膜、染色凝胶图像，扩展紫外(UV)光及荧光等应用。来自样品平台的光子由镜头捕获至CCD的感光单元（物理像素）上(图1)。CCD检测器通过收集感光单元上的光子转换为电荷，并将收集的电荷被转换成与光信号强度相关的数字信号。

图1 拍照式成像仪光学组件原理示意图。化学发光时，HRP酶与底物反应，样品本身作为光源进行成像。对于荧光成像时，需要激发光；由于标记的荧光基团不同，激发光波长也不一样。发射滤光片切入光路，用来截止特定波长的光并降低背景。镜头用来调焦以保证图像的清晰

激发光和光源类型

对于可见光和荧光应用，由紫外或白光气体放电管、氙灯或发光二极管(LED)提供照明或激发。

光信号收集

透镜用来收集来自成像平台的光。当与可调样品台一起使用时，透镜系统要么是固定的，要么是具有变焦能力，从而实现在单个视野中捕获不同样品尺寸。但是，缩放目标时，镜头的孔径会改变，导致灵敏度降低，因此，高度可调的样品托盘更好。最佳的光学系统是对于不同的托盘位置预先设置焦距，并且具有针对其他样本类型改变焦距的可能性的系统。

在荧光成像中，滤光片是用来去除特定波长的不需要的发射光。尽管化学发光检测不需要滤光片，但是仍然需要好的透镜来优化图像质量。由于化学发光很弱，大孔径的镜头在短时间内就能收集到更多的光。孔径因此特别重要，光源越弱，需要孔径越大。

系统性能

任何基于CCD拍照的成像仪其性能都以分辨率、灵敏度和线性动态范围来衡量。捕获图像的分辨率与CCD的几何形状、透镜系统的质量、像素的数目以及如果将像素合并(Bining)以提高灵敏度有关。

CCD阵列对光、温度和高能辐射敏感。来自热能、宇宙射线和前置放大器系统的暗电流都会引起噪声，从而影响仪器性能。CCD的主动冷却可以显著降低噪声水平，提高了灵敏度和线性范围。但实际上，这些都是为了解决捕获化学发光这种弱光信号的问题。

CCD成像的动态范围——仪器对样品产生线性响应的信号范围——取决于镜头和检测器

Amersham Imager系列 CCD拍照式成像仪

GE的Amershham Imager系列（AI）成像仪是用于凝胶和印迹的高灵敏、定量成像的数字系统。光源和滤光片的灵活组合可以装配到成像器中，用于化学发光、可见光图像捕获、紫外UV和红、绿或蓝(RGB)荧光进行检测。GE所有的Amersham Imager系列成像仪都具有主动冷却，以减少噪声水平，并提高灵敏度和线性范围。Amersham Imager成像仪也具有用于紫外和RGB成像的光源。

激发光源

用于检测荧光的扫描式成像仪通常使用激光器（Laser）激发。激光光源产生高度单色、相干和准直的窄光束。激光的聚焦能量和窄光束宽度的特性，有助于激光扫描仪获得极好的灵敏度和分辨率。CCD成像仪中使用的光源是比激光器简单小巧，也更便宜的发光二极管（LED），其产生宽谱带、低功率输出的激发光。

光信号收集

扫描仪系统中的光收集器件必须设计成尽可能有效地收集发射的荧光。在单通道或单标记的实验中，发射滤光片被设计成仅允许发射光的固定波段可以到达检测器。任何剩余的杂散激发或散射光（以及自身荧光）都应该被截止。

在多通道实验或多重标记检测中，每个通道发出的光必须单独检测。应该选择滤光片设置，结合荧光标记的选择，以确保不同的荧光标记能够在不同的波段上被检测，从而避免任何串扰（Cross-Talk）问题。在滤除荧光发射，并且仅保留所需波长之后，检测和定量。由于这个阶段的光强度非常小，必须使用光电倍增管（PMT）来放大和检测。

系统性能

激光扫描系统的性能可以通过系统分辨率、线性动态范围、均匀性和灵敏度来测量。

线性动态范围是仪器对样品产生线性响应的信号范围，因此是精确定量的重要参数。具有覆盖宽线性动态范围的扫描仪，可以在同一扫描中检测和精确地量化来自非常低强度和非常高强度目标的信号，而不会达到饱和。大多数激光扫描器的线性动态范围在10⁴-10⁵数量级之间。

整个扫描区域的均匀性对于可靠的定量至关重要。标定的荧光信号应该在成像场内的任何位置产生相同的结果。

特殊设计的移动扫描探头，在整个扫描区域内提供平场的激发光源和荧光信号的均匀收集，并且还可以降低光漂白效应，因为样品的任何部位暴露在激发源下的时间都非常短暂。

检测极限（LOD）是仪器在可信的水平下能够检测的最小样本量。具有较好LOD的仪器需要较少的荧光样品用于分析，并且允许更精确地检测不同样品之间的微小变化。

荧光基团和滤光片

为了产生荧光信号，照向样品的激发光必须在荧光基团的吸收光谱内。通常，激发波长越接近荧光基团的最大吸收波长即主吸收峰，激发效率越大。荧光基团团的主要吸收峰与有效激发的可用激发波长精确匹配不是必需的（见图2）。

图2 用532nm激光激发Cy3。Cy3的吸收光谱与激光器的532nm波长线重叠。

图3 使用580BP30滤光片(暗灰色区域)和560LP滤光片(亮灰色和暗灰色区域)对Cy3染料的滤光范围。BP=带通。LP=长通。

多色成像是指通过使用具有不同光谱特性的荧光标记物，同时检测和分辨多个目标。多色图像采集的过程根据成像系统的不同而不同。如果只有单个检测器的成像仪，使用不同的发射滤波器，配合使用不同的激发光，来获取多个图像。如果具有两个检测器时，可以同时收集来自两个不同荧光标记的组合或混合荧光，然后在信号到达检测器之前通过滤光片进行解析。

双重检测时需要分光器（beamsplitter）对混合荧光信号进行光谱分离，将得到的两个发射光束引导到分开的发射滤波片(荧光染料的最佳范围)，最后到达检测器。但是，发射光谱的重叠几乎是不可避免的。为了最大限度地减少发射光谱的交叉干扰，应当选择发射峰分离良好的荧光染料以及最合理的滤光片。为了获得最佳结果，应该选择发射峰间隔至少30nm的荧光染料。

两种典型的滤光片：

• 长通滤光片Long pass (LP) filters：

允许透过比约定波长更长的光谱，短波长的光谱将全部截止。

• 带通滤光片Band pass (BP) filters ：

允许一定波长宽度范围内的光谱透过，比约定的光谱波长更短或更长的光谱都会被截止。