【Cytiva】WB实验之荧光蛋白质免疫印迹

这种归一化方法比内参蛋白的归一化更为可靠，因为总蛋白受细胞处理或培养条件的影响最小。用于蛋白质总归一化的CY5预标记的实验方案，被优化为在宽范围的蛋白质浓度上的线性效果很好，并且不受细胞类型的影响。

在这个例子中，使用CY5总蛋白标准化（图1）研究了UV处理对HeLa细胞中Bax蛋白水平的影响。样品CY5预标记的膜上的总蛋白信号和Bax蛋白的靶向一级抗体和Cy3标记的二级抗体。CY5总蛋白信号显示随着UV处理的增加，蛋白质的浓度增加。然而，正常化后的总蛋白中观察到bax水平的下降。

Materials

Sample:Cy5 prelabeled 15 μg A431 lysate control and UV treated

Marker:Amersham WB molecular weight markers

Blocking solution:3% BSA

Primary antibodies:Rabbit anti-PP2A 1:750

Secondary antibodies:Amersham Cy3 labeled goat anti-rabbit 1:2500

当使用化学发光Western印迹法时，经常需要剥离和重新检测膜，然而，剥离过程具有蛋白质不均匀损失的风险。拥有Amersham ECL Plex，不再需要剥离和再探测，因为使用它复用检测。

使用一种Cy染剂和一种另一种Cy染蛋白的内参蛋白检测目标蛋白。

在下面的例子中，在成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2) 处理的野生型和敲除对照组中，成纤维细胞的裂解物中研究ERK ^1/2的活化。进行凝胶电泳，印迹后，用小鼠抗Erk^1/2和兔抗GAPDH同时检测膜，随后用Amersham ECL复合抗小鼠Cy5和Amersham ECL复合抗兔Cy3。虽然蛋白质定量分析表明，在每一个通道中都加了等量的总蛋白，但检测到内参蛋白GAPDH所发射的信号的强度不同，清楚地表明这并不是等量（图2）。与GAPDH水平无关，没有发现与野生型和敲除细胞相关的ERK^1／2激活的显著增加。然而，当抗GAPDH信号归一化时，ERK^1／2水平在刺激2和4 ng/ml的FGF-2后被敲除细胞中增加。

Materials

Sample:Cell lysates from FGF-2-treated wildtype (+/+) and knockout (-/-) mouse embryonic fibroblasts

Marker:ECL Plex Fluorescent Rainbow Markers

Membrane:Amersham Hybond LFP 0.2

Blocking solution:Amersham ECL Prime Blocking Reagent

Primary antibodies:Rabbit anti-MAP kinase ERK^1/2

Mouse anti-GAPDH

Secondary antibodies:ECL Plex goat anti-rabbit Cy5

ECL Plex goat anti-mouse Cy3

Detection:Amersham ECL Plex

Imaging:Typhoon laser scanner (now replaced by Amersham Typhoon)

Analysis:ImageQuant TL 7.0 (now replaced by ImageQuant TL 8.2)

Amersham ECL Plex的潜力在涉及相似大小和PTMS的蛋白质的可视化时特别巨大，能同时监测未经修饰的蛋白质形式的表达。此外，如果感兴趣的蛋白质被预测为在非常低的水平上表达，则重要的是避免样品损失和减少在膜剥离的过程中丧失固有的蛋白质活性。

在下面的例子中，用TGF-β刺激癌细胞后，分析Akt蛋白酪氨酸残基的磷酸化。首先在三-甘氨酸凝胶上分离pCU3细胞裂解物。然后将蛋白转移到Amersham Hybond-LFP膜（现在由Amersham Hybond-LFP 0.2取代）。封闭阻断后，用小鼠抗Akt和兔抗磷酸化Akt原抗体检测膜，其次是二抗Amersham ECL Plex抗小鼠Cy5和Amersham ECL Plex抗兔Cy3。

TGF-β刺激后AKT酪氨酸磷酸化增加。结果表明，用Amersham ECL Plex用检测使单个蛋白上的两个表位被识别并同时在单一的Western印迹上定量。（图3）

Materials

Sample:PCU3 cell lysate

Marker:ECL Plex Fluorescent Rainbow Markers

Membrane:Amersham Hybond-LFP (now replaced by Amersham Hybond LFP 0.2)

Blocking solution:Amersham ECL Prime Blocking Reagent

Primary antibodies:

(1) Mouse anti-Akt

(2) Rabbit anti-phosphoAkt

Secondary antibodies:

(1) ECL Plex goat anti-mouse Cy5

(2) ECL Plex goat anti-rabbit Cy3

Detection:Amersham ECL Plex

Imaging:Typhoon laser scanner (now replaced by Amersham Typhoon)

Analysis:ImageQuant TL 7.0 (now replaced by ImageQuant TL 8.2

想象一下，你必须研究两个感兴趣的蛋白质的表达，例如，有和没有PTM的蛋白质，例如磷酸化，在相同的印迹上归一化到内参蛋白。该实验应用要求使用三个荧光团，例如Cy2、Cy3和Cy5。需要同时检测三个蛋白，这三个蛋白的一抗又不同检测三种靶蛋白（每种蛋白的一抗不一样）的三通道，并且二抗在这些物种之间没有明显的交叉反应。使用Amersham ECL Plex进行分析，可以使用不同的细胞来源标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗同时检测样品中的两个目标蛋白。

三重检测特别适合于检测PTMs中的微小变化。例如，三种蛋白质，ERK，磷酸化ERK和内参蛋白GAPDH，同时使用三种不同种属来源的一抗进行检测。两种偶联的二抗（ECL Plex anti-mouse Cy3 和ECL Plex anti-rabbit Cy2）可从GE购买。另一方面，CY5与抗GAPDH一抗直接结合。（图4）

Materials

Sample: Cell lysates from non-irradiated (C) and irradiated (T) HeLa cells

Marker:ECL Plex Fluorescent Rainbow Markers

Membrane:Amersham Hybond-LFP (now replaced by Hybond LFP 0.2)

Blocking solution: Amersham ECL Prime Blocking Reagent

Primary antibodies:

(1) Rabbit anti-MAP kinase (ERK1-ERK2)

(2) Mouse anti-phospho-ERK

(3) Cy5-conjugated goat anti-GAPDH

Secondary antibodies:

(1) ECL Plex goat anti-rabbit Cy2

(2) ECL Plex goat anti-mouse Cy3

Detection:Amersham ECL Plex

Imaging:Typhoon laser scanner (now replaced by Amersham Typhoon)

Analysis:ImageQuant TL 7.0 (now replaced by ImageQuant TL 8.2)

对于极低丰度蛋白和其他弱信号的检测，三层荧光蛋白印迹是一种很好的选择。

在该技术中，一抗用于探测膜上的蛋白质。然后应用生物素标记的、种属特异性的二抗，接着是第三层，通常是与HRP或荧光团结合的链霉亲和素（图5）

图5 用生物素标记二抗的三层荧光Western印迹法的原理。与HRP（左）或荧光团结合的第三层链霉亲和素，如CyDye（右）作为检测试剂，与两层检测相比，灵敏度显著提高。

这种方法是提高两层检测灵敏度的一种特别有效的方法，并且在下面的例子中示出了癌细胞中ERK蛋白的表达。ERKs是哺乳动物MAP激酶家族的成员。他们已知激活许多转录因子，以及其他蛋白激酶。ERK信号通路的破坏是许多癌症的共同特征。由于它们是瞬时表达的并且在非常低的浓度下，因此它们的检测需要高度灵敏的系统。

对3T3小鼠成纤维细胞裂解物的稀释系列进行Western印迹分析，靶向ERK和内参蛋白GAPDH（图9.9）。在这种情况下，当使用Cy5标记的链霉亲和素的三层检测与两层检测相比时，综合信号强度的差异的比较表明信号强度增加约15倍。当检测到非常低的蛋白质丰度时，这种增加的灵敏度是简便的方法。

Materials

Sample:3T3 cell lysates

Marker:Full-Range Rainbow Molecular Weight Markers

Membrane:Amersham Hybond LFP 0.2

Blocking solution:5% BSA

Primary antibody:Rabbit anti-ERK 1/2 Mouse anti-GAPDH

Secondary antibodies:ECL Plex goat anti-rabbit IgG Cy5,

ECL Plex goat anti-mouse IgG Cy3

Biotin-conjugated donkey anti-rabbit IgG

Third layer reagents:Cy5-conjugated streptavidin

Detection:Typhoon laser scanner (now replaced by Amersham Typhoon)

Imaging:Typhoon laser scanner (now replaced by Amersham Typhoon)

Analysis:ImageQuant TL 7.0 (now replaced by ImageQuant TL 8.2)

当需要高分辨率时，2-D Western印迹分析特别适合于复杂的分析。

在这个例子中，通过使用Amersham ECL Plex对PCu3细胞进行定量复用分析，对糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的磷酸化位点进行了表征。通过等电聚焦（根据电荷的分离），然后通过SDS-PAGE（根据尺寸的分离）分离细胞裂解物。印迹后，用小鼠抗GSK3β和一个兔抗体对其磷酸化的配对物PGSK3β进行检测。然后用ECL绒山羊抗小鼠IgG -CY3和ECL复合山羊抗兔IgG-CY5（ ECL Plex goat anti-mouse IgG- Cy3和 ECL Plex goat anti-rabbit IgG-Cy5）对膜进行检测。

GSK3β上的每一个额外的磷酸盐基团可诱导迁移并可测量变化。2-D Western印迹实验给出了与1-D蛋白印迹（图9.10和9.11）相比的磷酸化状态的附加信息。与磷酸化GSK3β相对应的带在1-D实验中（MR 48 000）被分解为至少五种不同的蛋白质亚型，其中两种蛋白在丝氨酸9上磷酸化。

Materials

Sample:PCU3 cell lysate

Immobilized pH

gradient (IPG) strip:Immobiline Dry Strip pH 7–11 NL, 7 cm

Membrane:Amersham Hybond P 0.45

Blocking solution:Amersham ECL Prime Blocking Reagent

Primary antibodies:Mouse anti-GSK3β

Rabbit anti-pGSK3β

Secondary antibodies:ECL Plex anti mouse IgG-Cy3

ECL Plex anti rabbit IgG-Cy5

Detection:Amersham ECL Plex

Imaging:Typhoon laser scanner (now replaced by Amersham Typhoon)

图7 对一抗GSK3β抗体，和ECL融合CY3结合的二抗进行Western blot扫描。（b）ECL融合Cy5偶联的抗磷酸化GSK3β、（c）A和B重叠的一抗和二抗

图8  用Amersham ECL Plex检测天然和磷酸化GSK3β的二维Western印迹分析。（a）Cy3图像，（b）Cy5图像，（c）Cy3和Cy5图像的叠加。绿色图像＝靶向抗GSK3β蛋白（Green）的一抗的ECL融合的Cy3结合的二抗。红色图像＝针对磷酸化GSK3β蛋白（PGSK3β）的一抗的ECL pRX-5偶联的二抗。

在参考文献1中可找到关于本节中应用实验内容的更多细节。