【Cytiva】WB实验流程之剥离和二次孵育
在一些应用中，需要检测同一张膜上多个蛋白，尤其是无法使用前述的多通道荧光检测方法进行定量分析时，可以通过剥离（strap）和二次孵育（reprobe）来实现，但是会有损失膜上蛋白的风险。剥离和二次孵育可以实现不同一抗与印迹点结合，节省时间和样品。然而，剥离条件可能会导致蛋白从膜上脱落，导致灵敏度降低。控制膜上蛋白的损失至关重要。
通过使用洗涤剂、还原剂、加热或低pH的组合，通常可以找到最适条件。在下面的章节中，将讨论您选择蛋白质印迹系统的最佳实验条件的问题。
注意，在抗体孵育之前可能需要重新封闭。
替代剥离的方法是使用标记有荧光基团的二抗同时检测一种以上的蛋白。
使用加热法和清洁剂进行剥离
基于ECL化学发光的Western Blotting检测方法中，使用加热和清洁剂的方法去剥离膜 。用2%SDS、100mMβ-巯基乙醇、62.5mM Tris-HCl中，pH 6.8、70℃下进行膜上的抗体洗脱30分钟。较低的温度(50°C至70°C)也可能起到不错效果，但应选择验证过的抗体。（见下文）
膜剥离过程的优化方法
首先需考虑的参数是温度。假设有足够量的纯化蛋白，可通过斑点印迹法验证最佳洗脱温度。如果蛋白量有限，则将膜剪成条。在50℃下进行洗脱，之后用二抗对膜进行孵育，以检查效率。如果在这些条件下发现剥离是不充分的，可以增加5°C重复该过程。该优化步骤有助于确定剥离抗体的最佳条件，同时使膜上的目的蛋白损失最小。
除温度之外，还应考虑抗体亲和力和目的蛋白丰度。表1中描述了四种策略。
表1
实验环境 | 步骤1 | 步骤2 | 步骤3 |
策略1 两种相近丰度蛋白及两种相似亲和力的抗体 | 首先检测一种蛋白 | 洗脱 | 检测另一种蛋白 |
策略 2 两种相近丰度蛋白, 不同亲和力的抗体 | 首先检测一种蛋白使用低亲和力抗体 | 洗脱 | 检测蛋白使用高亲和力抗体 |
策略 3 不同丰度的两种蛋白,两种相似亲和力的抗体 | 检测低丰度蛋白 | 洗脱 | 检测高丰度蛋白 |
策略 4 不同丰度的两种蛋白,不同亲和力的抗体 | 检测低丰度蛋白 | 洗脱 | 检测高丰度蛋白 |
在第一种策略中，如果抗体亲和力和每种蛋白质的丰度都近似相等，那么先检测哪种蛋白并不重要。
第二种策略强调首先用亲和力最低的抗体检测相似丰度蛋白的重要性。该策略确保先进行不太剧烈的洗脱，检测效果较好。
第三种策略说明了一抗亲和力相近的情况下，先检测低丰度蛋白的重要性。
第四个策略很难评估。一般来说，最好先检测丰度最低的蛋白，因为蛋白损失可能对检测低丰度蛋白影响更大。
低pH溶液剥离
如果加热和洗涤剂剥离不能得到满意的结果，另一种方法是使用25mM甘氨酸-盐酸溶液，pH 2.0，添加1%SDS剥离膜。膜应该在连续搅拌下在洗脱液中浸泡约30分钟。该技术的效率可以与用加热和洗涤剂剥离的方式来横向比较。如果没有完全剥离，增加在剥离溶液中的孵育时间可能有助于去除抗体，但是有洗脱目的蛋白的风险。因此，建议浸泡在酸性剥离液中的时间不超过1小时。
在化学发光应用中，可以尝试使用温和的方式剥离膜（Amersham Protran Premium 0.2 and 0.45 nitrocellulose or Amersham Hybond 0.2 and 0.45 PVDF），室温下0.2M甘氨酸（pH 2.8）处理30分钟，之后使用TBS-T或PBS-T洗两遍，各10分钟。然后进行再一次封闭及抗体孵育。
高pH溶液剥离
如果一次孵育后信号较强，可将膜浸泡在高pH溶液中进行剥离。通常在0.2M NaOH中孵育5分钟，然后水洗5分钟。如果仍有信号残留，则将NaOH浓度提高到2M，将培养时间延长到30分钟。在使用NaOH剥离后，通常不需要重新封闭，但是也应考虑NaOH浓度和浸泡时间，确定是否需要进行封闭。
高盐溶液下进行剥离
高盐浓度已被证明是另一种有效的解决方案。将膜浸泡在添加0.5M NaCl和0.2%SDS的PBS或TBS缓冲液中30分钟至2小时，然后用水冲洗。在使用盐进行剥离后，通常不需要重新封闭，不过仍需根据浸泡时间，确定是否需要进行封闭。
提示和技巧
介绍一种节省时间的剥离过程替代方法，可以采用ECL顺序标记法快速检测膜上第二个目的蛋白。在ECL检测出第一个目的蛋白后，使用过氧化氢（H2O2）灭活（猝灭）HRP，并清洗膜。然后，可以在没有来自第一标签的干扰的情况下，标记和检测第二个目的蛋白。猝灭HRP标记的蛋白质信号所需的H2O2浓度将取决于HRP的含量和膜孵育的时长。
通常，用15% H2O2在PBS中孵育30分钟可以得到良好的结果。然后将膜在PBS中洗涤三次5分钟，并重新进行第二次蛋白质检测。
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