【Cytiva】WB转印缓冲液及转印条件
在文献中描述了几种转印缓冲液的配置方法，最佳选择取决于实际应用。转印缓冲液作为导电介质，其中蛋白质是可溶的，它不应影响蛋白质与膜的结合。取决于缓冲液的pH，蛋白转移可以朝向阴极(-)或朝向阳极(+)。此外，分子与膜的结合力受缓冲液特性(如盐类型和浓度)、甲醇浓度以及洗涤剂(如SDS)存在的影响。
●如果转印缓冲液和电泳缓冲液不同，则凝胶在转印之前应放入转印缓冲液中进行平衡，以确保凝胶接触膜之前发生任何膨胀或收缩。该步骤的省略可能导致条带变形或条带分辨率降低。
大多数转印缓冲液中含有甲醇。为了实现蛋白分子与膜，尤其是硝化纤维素膜(6)的有效结合，甲醇的加入是必要的。去除可与蛋白质结合的SDS，可提高分子与膜的结合力。然而，甲醇可能造成凝胶收缩，进而导致蛋白质洗脱率降低。这种效应在大分子量蛋白的转移中更为明显。因此，对于大分子蛋白的转移，建议使用低浓度的甲醇并在转印之前进行较长时间的平衡。
●长期储存后，含有甲醇的缓冲液会变质——在转印之前加入甲醇。
●应选用分析级甲醇，低级甲醇含有金属污染物，污染物将会沉积在电极上。
SDS对蛋白质与膜的结合是不利的，通过平衡15至30分钟，所有剩余的SDS应该在转印之前从凝胶中除去。然而，如果大分子蛋白难溶，或含有过量的疏水性氨基酸，那么需要在转印缓冲液中加入少量的SDS(0.02%至0.1%)。
●如果样品洗脱速率缓慢，则需要较长的转印时间。如果蛋白结合不充分，可尝试不同的缓冲液。
●乙醇可以代替甲醇，且更环保。
最广泛使用的蛋白转印缓冲液是经典的Towbin缓冲液。（192mM甘氨酸，25mMTris，20%甲醇[V/V]）。这种d低离子强度缓冲液的pH为8.3，高于大多数蛋白质的等电点(pI)，导致带负电的蛋白质朝向阳极（+）。在pH 11下含有N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)的缓冲液，推荐用于后续测序应用。使用这种缓冲液减少了与Edman化学测序反应结合时，Towbin缓冲液中的甘氨酸产生的高背景的问题。
一般原则是在使用循环缓冲液时使用Towbin缓冲液，但是由于制造商的建议不同，应该遵循每个系统提供的使用说明。半干转印应使用非循环缓冲液。非连续流缓冲液是基于等速电泳理论。使用两个浓度不同但pH相同的Tris缓冲液作为阳极(+)缓冲液。阴极（-）缓冲液具有较低的pH并含有酸。阳极(+)缓冲区的功能是中和阳极(+)板表面产生的过量质子。阴极（-）缓冲液中的酸在转移过程中通过凝胶迁移到阳极（+），并充当尾随离子。
Towbin和Laemmli缓冲液的pH值通常为8.3左右，不应该用酸或碱来调节。这将导致导电性问题，这会严重破坏实 验及损坏设备。
关于大分子及小分子蛋白转移的说明
SDS和甲醇在转印缓冲液中的相对含量、蛋白质大小和丙烯酰胺凝胶中的丙烯酰胺比例都会影响转印效率。可以采取以下方法来优化转印效率：
针对大分子蛋白 (分子量> 10kDa)
●配胶时使用低浓度丙烯酰胺
从凝胶到膜的蛋白转移可以放缓，如同跑胶时蛋白缓慢迁移。如果转印大分子蛋白，电泳胶需降低聚丙烯酰胺浓度。低密度凝胶很脆弱，须小心处理。
●多一点SDS，少一点甲醇
大分子蛋白质会沉淀在胶中，提高转印难度。将最终浓度0.1%的SDS添加到转印缓冲液中，将有效避免上述情况。此外，甲醇削弱了SDS与蛋白质之间的相互作用，因此将甲醇减少到10%或更少，将减少蛋白沉淀的风险。
●选择湿转
并且降低转印速度，通过降低电压或电流，增长转印时间。此外，在4°C进行转印有助于缓解产热的影响，例如凝胶变形。
针对小分子蛋白 (分子量< 10kDa )
●转印缓冲液中不加SDS
SDS阻碍了小分子蛋白与膜的结合
●甲醇浓度控制在20%
可去除SDS，并提高转印效率
电流和转印时间
电流和转印时间是重要的设置参数. 电流或电压不够以及转印时间不足会导致蛋白转移不充分，过长时间的转印则会导致蛋白损失-特别是小分子蛋白将直接穿过转印膜，俗称"blow-through"，过高的电流或电压会造成过量产热。
如果需要较长的转印时间，则应使用湿转方法，需要通过主动冷却手段来避免温度升高的影响。半干转不适用于长时间转印，因为电极板之间的少量缓冲液会干涸，导致转印停止，并对印迹膜和印迹装置造成不可逆地损伤。通常，湿转是在恒压下进行的，因此在转印过程中电流的增加会产热。为了避免过热，可使用预冷的转印缓冲液或在冷室中进行转膜。某些转印设备具有冷却元件或可在冰块中使用。搅拌有助于均匀缓冲液的温度。半干转是在恒流（0.8mA/cm2）下进行的。高电流有可能会损坏印迹膜和设备。
监测并优化转印方法
上述湿转和半干转的标准方法适用于大多数转印实验，如果转印中出现问题，可尝试以下步骤：
●转印缓冲液中加入0.1%的SDS以增强大分子蛋白的溶解度，加入20%的甲醇以增强膜的结合力。
●分两阶段进行转印（仅用于湿转）。在低电流(1mA/cm2)下转印1小时，从而帮助蛋白在膜上的停留时间更长，可以改善小分子蛋白的结合。为了转移较大分子蛋白，再加第二阶段的较高电流（3.5至7.5mA/cm2）。
●转印后对凝胶进行染色，验证所有蛋白是否完全洗脱。通过预染marker监测到转膜效率。此外，可使用丽春红等可逆染色剂对膜染色进行验证。
●在凝胶的阴极(-)方向放置一张转印膜，以检测组蛋白、核蛋白等带正电的蛋白。此方法需变性胶在无SDS的缓冲液中增加平衡时间，或使用非变性胶，方法仅适用于转膜蛋白的等电点高于缓冲液的pH的情况下。
●放两张转印膜以捕获穿过第一张膜的小分子蛋白。
其他细胞品类
别划走，精彩继续
长按识别
添加一对一专属技术支持
扫码进群
咨询详细产品信息
点在看，传递你的品味
