【Cytiva】WB实验流程之一抗和二抗孵育

虽然有时需要合成针对新发现或特殊目的蛋白的一抗，但通常可选择商品化抗体开展实验。选择一抗时注意以下几点。

1. 抗体的选择取决于目的蛋白如何折叠，因为不同的表位将在不同的条件下暴露出来。

2. 变性抗原刺激下，动物免疫生成的抗体可识别隐藏在蛋白内部的表位，并可与变性蛋白有效结合。

3. 如果目的蛋白是天然蛋白，则必须识别蛋白质表面的表位。在这种类型的应用中，使用天然抗原进行免疫效果较好。

●购买商品化一抗时，确保厂家已验证此抗体适合Western Blotting应用。

●重复使用一抗溶液可减少消耗，但储存时需避免失活。使用干净的试管，不使用时冷藏保存，孵育膜时使用干净的盒子。

●使用小盒子进行孵育节省抗体。如果蛋白分子量及蛋白质在膜上迁移的位置已知，可在转印后将膜切成较小尺寸

●使用印迹管可逐个泳道进行孵育，用于筛选抗体及节约抗体用量。

单克隆和多克隆抗体都可以用于蛋白质印迹分析（图1），两种类型都有优点和缺点。虽然多克隆抗体更敏感，但其特异性比单克隆抗体低。反之，单克隆抗体往往更具特异性，但敏感性较低。通常选择多克隆抗体是因为相对较便宜。单克隆抗体仅与一个表位结合，并且具有高度特异性、纯度高和一致性好的性能，且低背景。天然抗体制剂，如血清（多克隆抗体）或腹液（单克隆抗体）有时用于蛋白质印迹，但其杂质会增加背景。为了提高信噪比，抗体可用固定抗原或固定的蛋白A或蛋白G进行亲和纯化。抗体亲和纯化的基础是蛋白A和蛋白G，对来自不同种属IgG的Fc区的高亲和性和特异性。蛋白A或蛋白G被固定在几种不同的基质上，从而建立了从腹液、细胞培养上清和血清中分离IgG和IgG亚类的好方法。

GE提供用于抗体纯化的层析树脂，包括ready-to-use HiTrap Protein A/HiTrap Protein G HP柱。柱子分别用蛋白A-或蛋白G Sepharose™高性能层析树脂预填充。使用注射器、泵或层析系统时，可使用以上树脂快速和方便地纯化抗体。也可使用旋转柱和重力流动操作柱等方式。抗体纯化及综合产品目录请参看Affinity Chromatography Handbook, Vol. 1: Antibodies,18103746.

图1  单克隆抗体只与抗原上的单个特异性表位结合，多克隆抗体由对几个表位的特异性的混合物组成。通过对靶蛋白片段进行亲和纯化，可以提高多克隆抗体的特异性。或者抗体的特异性可通过在免疫过程中通过基因编辑改造或截断抗原仅保留目的表位等方法提高。

一抗需要具有怎样的特异性？一抗的特异性取决于待测蛋白的研究目的，例如检测跨膜受体的生长因子结合结构域，需要针对该蛋白胞外结构域的抗体。另一方面，从受体到次要信使的构象依赖性信号转导的研究需要针对受体胞内结构域的特定序列的抗体。此外，高特异性在检测已定义的磷酸化氨基酸残基的应用中是至关重要的，并且可能需要单克隆一抗。

此外，对不同种属的蛋白相似性的知识，有助于确定新的一抗是否可用。有时可使用来自其他哺乳动物的相同蛋白的抗体，在人类样本中检测高度保守的蛋白质，例如胰岛素。此外，许多小鼠和大鼠的蛋白质高度相似。但通常来讲，需要使用与蛋白相同种属的一抗。此外，当在同一膜上使用另一种一抗来结合不同的蛋白质进行多重检测时，需要注意抗体的种属来源，必须在不同的动物物种中产生一抗，以便被特异性的二抗单独识别。

一抗应尽可能避开样品物种进行获取。最好在兔子而不是大鼠体内培养抗小鼠蛋白的一抗。

在使用一抗时，重要的是优化浓度以获得最佳结果。一抗浓度过高是导致不良结果的常见原因，例如高背景、非特异性条带或信号强度过高。一般高灵敏的蛋白质免疫印迹发光液，如Amersham ECL Prime (货号28980926) 和Amersham ECL Select (货号：29013864) ，只需低浓度的抗体，特别适合抗体稀少或较昂贵时使用。初次选择一抗浓度应遵循厂家的建议。不同抗体批次之间的性能差异通常很小，可以进行滴定法验证。血清中多克隆抗体的浓度可能因动物不同而变化,也可能因血样不同而变化。当观察到结果不理想时，应当进行另一次滴定检测。

一抗的孵育温度也很重要，温度与结合力成正比关系，既有特异性的 (增加信号) ，也有非特异性的 (增加背景) 。一般建议室温1小时或4℃过夜。抗体稀释液一般使用洗涤缓冲液（PBS或TBS）。如果遇到高背景问题，抗体溶液中可以加入封闭液，如BSA或脱脂牛奶和低浓度洗涤剂，如0.05%至0.1%V/V吐温-20或SDS。在选择稀释抗体的溶液时，须保持抗体的生物活性，可遵循制造商的建议！

洗脱步骤

一抗孵育后，有必要洗膜去除过量的抗体，以避免高背景及低信噪比。高浓度抗体孵育后，通常使用加入0.05%到0.1%吐温-20的PBS或TBS洗涤液进行洗脱。PBS-吐温适用于多数洗涤过程，TBS更适合于磷酸化蛋白洗涤过程，这是由于PBS中的磷酸盐可能会影响抗体结合。

●注意，过多的洗涤剂会从膜上洗掉目的蛋白，减少或消除信号。对于单克隆抗体或高纯度多克隆抗体，宜选无洗涤剂洗涤缓冲液。根据经验选择合适的洗涤次数。洗涤不充分将导致过多的背景，而过度洗涤可能洗脱抗体并减少信号。

●洗脱步骤应根据检测试剂生产商的建议进行。作为一般指南，洗涤应在大约4mL的洗涤缓冲液平方厘米膜的体积内进行至少三次(5分钟/洗涤)，并持续搅拌。

商品化的二抗种类很多，根据一抗的种属进行选择。例如，如果一抗是IgG同种型，来源于山羊，则二抗必须是在其他物种中产生的抗山羊IgG抗体，因为它将结合一抗的Fc区。虽然没有严格的规则，但在某些宿主物种产生的二抗可导致高背景。在这种情况下，需要改变二抗的种属来源。

二抗的孵育过程与一抗孵育类似。

抗体稀释比例应遵循生产商说明书，1：100到1：500000可选。Amersham ECL Prime 及Amersham ECL Select 等高灵敏发光液需较低抗体浓度即可。

标记抗体的选择

在选择二抗时，须考虑是否适合当前的检测方法。可以选择预标记的二抗，也可以使用试剂盒自行标记，以适用于多数应用。

抗体的Fab或F(ab')2片段也可以以标记或未标记的形式获得。这些片段适用于检测抗体的Fc部分与存在于蛋白质样品复合物中的Fc受体之间是否已无结合的试验。

酶：碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP）是Western实验中检测蛋白最常用的两种酶，两者都可以与化学发光、化学荧光或显色底物一起使用。AP的优点在于其反应速率保持线性，允许通过延长与基底的孵育时间来提高灵敏度。然而，增加培养时间常常导致高背景、低信噪比。由于底物特异性高，HRP的背景值通常较低。在两种最常用的酶中，HRP是优选的，因为它具有高活性、稳定性、更宽的底物范围(表1)。

表1 AP和HRP作为二抗结合物的一些关键特性

荧光基团：荧光检测具有高灵敏度、检测动态范围宽以及信号保留时间长等优点，是定量检测的合适方法。

多光谱荧光检测的基础上，可使用 Amersham ECL Plex 进行多个蛋白质检测（多重检测或重复使用）。多通道检测可以同时检测目的蛋白和看家蛋白，而不需要剥离和重新孵育，蛋白定量更准确。Amersham ECL Plex 的多通道检测能力，特别适用于检测分子量相近的目的蛋白。比如检测同一蛋白质的磷酸化和非磷酸化异构体，检测通道之间干扰少，无论信号强度大小，都可以被准确定量。另一种多通道检测方法是用一个荧光基团（Cy5）对全部样品进行预标记，并用Cy3标记的二抗检测目的蛋白。这个实验即为总蛋白归一化，避免了看家蛋白表达的不稳定性。

生物素化二抗：通过使用生物素化抗体，生物素/链霉亲和素两步法可以用来增加信号强度，帮助检测低丰度蛋白。

在这个三层系统中，应用生物素标记的二抗与使用染料、荧光团、放射性同位素或酶标记的链霉亲和素/亲和素，导致生物素和链霉亲和素，发生不可逆的相互作用(图2)。此外，多个生物素分子可与抗体结合，抗体又可与多个链霉亲和素分子相互作用，可以放大放大信号并提高目的蛋白检测的灵敏度。

图2 链霉亲和素与生物素结合非常强。可以通过链霉亲和素与HRP偶联来检测膜固定化抗原。如果多个生物素分子附着于每个二抗，则每个生物素中多个链霉亲和素分子的扩增效果进一步增强。

金结合抗体：金颗粒可以附着在链霉亲和素或二抗上。金颗粒带负电荷，与膜结合很弱。蛋白质的特异性标记是通

过疏水力和离子相互作用实现的。蛋白质通过金颗粒的积累而染成深红色。当与银增强剂一起使用时，结合力可以增强10-100倍。AuroProbe系列抗体常用于负电荷膜，由消化纤维素 (NC) 或聚偏氟乙烯 (PVDF) 等材料制成。膜应该用手套和镊子来处理，以免弄脏。

放射性同位素：放射性同位素抗体已被广泛使用，但价格昂贵且保质期短，需要特殊的废物处理和回收，并要求安全、有资质的工作环境。鉴于以上原因，酶和荧光基团等标签通常是首选。