【Cytiva】WB实验流程之电泳

电泳是一种基于大小、形状以及电荷差异进行蛋白质分离的常用方法。本章节是帮助您选择合适电泳条件，以便得到最好的电泳结果。

蛋白质可以在电泳后通过凝胶染色分离和检测，也可以进行蛋白质组学应用的2-D凝胶电泳的专门过程，本章将主要集中介绍蛋白转印之前的1-D凝胶电泳。

我们将讨论一些电泳过程中最重要的变量，如是否使用天然或变性条件，选择最合适的凝胶密度(丙烯酰胺百分比），以及建议最合适的缓冲液系统。

电泳是一种基于带电分子在电场中的迁移率的分离技术。它主要用于分析和纯化大分子，如蛋白质或核酸。

电泳通常是通过将目的蛋白样品加载到多孔基质中，然后对多孔基质施加电压。样品中不同大小、形状和带电的分子以不同的速度穿过基体。在分离结束时，在基体中的不同位置检测条带形式的分子（图1）。基质可以由许多不同的材料组成，包括纸、醋酸纤维素或由聚丙烯酰胺、琼脂糖或淀粉制成的凝胶。在聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶中，基质以颗粒尺寸作为选择性分离的方法。

图1 在上槽中设置阴极（-）缓冲器和在下槽中的阳极（+）缓冲器设置垂直电泳装置。在样本孔中的分子向电场中的阳极（+）迁移。

在设定的时间之后，分子将根据它们的大小、形状和电荷迁移到位置。作为垂直电泳系统的替代物，水平电泳系统也是可用的。

聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶分别是用于蛋白质和核酸分离的研究实验室中最常用的多孔基质。这些凝胶的孔的大小与许多蛋白质和核酸的大小相似。当分子通过施加的电压被迫穿过凝胶，较大的分子在它们的迁移中比更小的分子延迟。对于任何特定的凝胶，明显小于基质中的孔的分子根本不迟缓；它们几乎游离于游离溶液中。在另一个极端，比凝胶孔大的分子根本不能进入凝胶。

在大多数电泳槽中，凝胶被安装在两个缓冲室之间，使得阳极（+）和阴极（-）室之间的唯一电连接通过凝胶。凝胶有许多尺寸，在凝胶密度和样品孔数来进行选择，预制或手工制作，最佳的组合取决于令自己满意分离所需的距离和样品量。电泳已经有水平和垂直方向了。

聚丙烯酰胺凝胶（图2）是惰性的交联结构。这些凝胶中的孔径与许多蛋白质的分子半径相似。当分子在电场中被强制通过凝胶时，较大的分子被凝胶阻滞。

图2 聚丙烯酰胺凝胶具有丙烯酰胺聚合物之间的双丙烯酰胺形成的共价交联。

凝胶（表1）是通过将化学引发剂和催化剂（例如过硫酸铵[APS]和TEMD）加入丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体的溶液中来进行交联链式反应的。或可通过光化学法诱导交联，其中核黄素和长波紫外光（UV）是激发条件。

聚丙烯酰胺凝胶是电泳应用的理想原因，聚丙烯酰胺是一种透明的、强的、相对化学惰性的热稳定介质。它的多功能性在于它可以用宽范围的孔径来制备，决定了不同大小的蛋白质如何在胶内迁移。凝胶的孔径可以由实验者控制，并且由丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺交联剂的浓度决定。

平均孔径是由交联剂的用量和丙烯酰胺的总量决定的。聚丙烯酰胺用于分离大多数蛋白质，分子量（MR）介于5000和200之间。

表1 凝胶电泳中常见的化学试剂

凝胶通常由两个不同密度的部分组成，在两个玻璃板之间制备得来。第一部分制备的，称为分解或分离凝胶，由高丙烯酰胺和双丙烯酰胺的浓缩液。当该层灌胶后，从丙烯酰胺和双丙烯酰胺的低浓度溶液制备的称为浓缩或间隔凝胶的第二凝胶被浇铸在分解凝胶之上（图1）。叠层凝胶的高度应至少是每个样品中的两倍。在玻璃板之间插入梳子进入未聚合的堆叠凝胶中，以产生上样孔。凝胶凝固后将梳子小心地去除，然后用吸管或注射器冲洗缓冲液冲洗样本孔。

通过最初通过较低密度的浓缩胶运行样品，在样品浓度到达分离胶之前，蛋白质在几分钟内浓缩成薄的起始区；这个过程被称为等速电泳。因此，两种凝胶密度之间的界面可以被看作是每个孔中所有蛋白质的起始线，并且在进入分离胶后，蛋白质开始根据大小而分离。

凝胶的密度（孔径）是影响蛋白质分离图谱的重要因素。在一定密度的凝胶中，小蛋白快速迁移，而大蛋白迁移缓慢，因而分解成更为离散的带，而这些蛋白质几乎不能穿透凝胶。当需要分离的蛋白分子量在较宽范围内时，应使用梯度凝胶，其中聚丙烯酰胺网密度朝向阳极（+）增加。在这样的凝胶中，在给定的时间内，小的蛋白质将到达凝胶的致密区域，而较大的蛋白质将在较不致密的区域内迁移（表2和图3）。因此，分离胶所提供的胶条长度足以在较宽的分子量范围内精确测量蛋白质大小。

如果已知样品中感兴趣的蛋白质的大小，则可以选择特定分离胶的密度以在特定分子量附近最佳分离蛋白质，低密度矩阵提供更大蛋白质的更好分辨率。另一方面，如果不知道样品中蛋白质的大小，可能需要测试几种丙烯酰胺浓度以优化分离条件。在表2中，显示了在不同分子量范围内使蛋白质线性分离的丙烯酰胺浓度。

虽然在指定范围之外的蛋白质也在凝胶中迁移，但它们的迁移率将不符合线性迁移模式。

表2 含有聚丙烯酰胺凝胶的十二烷基硫酸钠中丙烯酰胺的推荐含量，用于在规定的尺寸范围内对目标蛋白进行线性分离。

然而，并非需要对所有相关蛋白质的严格线性分离。例如在涉及两个靶蛋白的Western印迹应用中，选择最适合解决这两种蛋白质的聚丙烯酰胺浓度的凝胶更为重要。图3展示了均一（单一浓度胶）和梯度凝胶中不同大小蛋白质的迁移模式示意图。

图3

Fig 3 When selecting a gel, it is important to use an acrylamide concentration that will allow optimal separation of the proteins in your sample.

High molecular weight proteins will be optimally resolved in gels containing a lower acrylamide content, while smaller proteins should ideally be run in more acrylamide-dense gels. The image shows the separation pattern for nine different proteins for each acrylamide concentration.

蛋白质是两性的（或两性离子）化合物，因此它们带正电荷或带负电荷，因为它们包含酸性和碱性氨基酸残基。蛋白质上的大部分电荷来自氨基酸侧链上的羧基和氨基的pH依赖性电离。由于这些基团可以在正常电泳pH范围内滴定，蛋白质的净电荷由周围介质的pH和携带氨基或羧基的氨基酸的数量和类型决定。翻译后修饰（PTMS），如巯基交联，并阻断氨基或羧基末端也可能影响蛋白质的总电荷。

对于每种类型的蛋白质，都有一个pH，分子没有净电荷。在这个称为等电点（PI）的pH值下，弱酸和碱被滴定到分子上有相同数量的正电荷和负电荷的点。每一种蛋白质都具有特征性的π。在pH高于PI的溶液中，蛋白质具有净负电荷，并在电场中向阳极（+）迁移。当在pH低于PI的溶液中，蛋白质具有净正电荷并向阴极迁移（-）。对于基于蛋白质迁移率的电泳分离，溶液的pH必须保持恒定以维持电荷，因此保持蛋白质的迁移率。当电极处的水电解产生离子，例如H+时，电泳中使用的溶液被缓冲。

在蛋白质凝胶电泳中使用了连续和非连续两种缓冲体系。连续系统使用相同的缓冲液槽和凝胶。在非连续的系统中，两个凝胶层分别用不同的缓冲液制成。连续系统比非连续系统更容易操作，并且不容易出现样品沉淀和聚集等问题。然而，非连续缓冲液系统提升了电泳分辨率，因此使用更加广泛。

Laemmli（Tris glycine）不联通缓冲体系是最常用的，由pH 6.8的堆叠凝胶和pH 8和9之间的分辨凝胶组成。

这种通用的系统的一个潜在缺陷是，在该相对高的pH下，二硫键倾向于在半胱氨酸残基之间形成，而通过向样品中加入还原剂可以减轻这个问题。可替代地，这个问题可以通过使用在较低pH下解决蛋白质的缓冲剂来解决。例如，具有7.4至8.8的有用缓冲范围的两性离子氨基酸的三齿胺被用作不连续系统中的尾离子，用于分离低于10×000（1）的MR多肽。

在缓冲体系中包含抗衡离子已被证明是有利的电泳分离蛋白质的MR 1000至100（000）（2）。该缓冲体系分别使用双胍和硫酸盐作为尾离子和超前离子，Bis tris和TrIS分别作为堆叠和分解相中的反离子。这种反离子原理使得我们可以分离比使用更常用的Laemmli系统更宽范围的快速迁移蛋白质。

基于TIS的运行缓冲器的其他变体包括三乙酸乙酯和三嗪三元缓冲液，它们更适合于GE的Excel预制胶。

天然或非变性凝胶电泳是在没有SDS的情况下进行的。而在SDS-PAGE中，蛋白质的电泳迁移率主要取决于分子质量，而天然PAGE中的迁移率则取决于电荷和流体力学尺寸。

一定缓冲液pH值下，蛋白质的固有电荷取决于蛋白质的氨基酸组成以及PTM，例如添加唾液酸。由于蛋白质在活性状态下保持其折叠构象，其水动力尺寸和凝胶上的迁移率也会随着这种构象的性质而变化（更高的流动性，更紧凑的构象，对于更大的结构来说更低）。如果在中性pH附近进行天然PAGE，以避免酸或碱变性，则可用于研究构象、自结合或聚集以及其他蛋白质或化合物的结合。

因此，天然凝胶对任何改变蛋白质电荷或构象的过程都很敏感，使其成为应用的极好工具，例如：

●由于化学降解（例如脱酰胺）引起的电荷变化

●折叠/展开引起的构造变化

●聚集（共价和非共价）

●结合事件（蛋白质或蛋白质配体）

天然凝胶非常适合分析加速稳定性样品，证明不同批次或工艺的可比性，或检查赋形剂的效果。天然凝胶的另一个优点是分离后可以在天然状态下回收蛋白质。然而，在固定或染色之前，可能需要恢复活性生物材料。

在本手册中，我们主要关注电泳后的一维印迹，其中蛋白质根据大小进行分离。然而，在蛋白质组学领域中，需要对蛋白进行更深入的研究，为此，2-D凝胶电泳被广泛使用。也可用作蛋白质印迹前的分离步骤。

蛋白质首先通过等电聚焦（IEF）分离，这是一种电泳方法，根据pi分离蛋白质。蛋白质是两性分子，这意味着它们携带正电荷、负电荷或零净电荷，这取决于氨基酸组成和周围介质的酸碱度。PI是蛋白质净电荷为零时的特定pH值。在IEF中，使用了pH梯度，在电场的影响下，蛋白质将移动到其净电荷为零的梯度位置。分离的分辨率由电场强度决定，因此IEF在高压（通常超过1000 V）下执行。当蛋白质到达其在pH梯度中的最终位置时，系统中的离子运动很少，从而导致非常低的最终电流（通常低于50μA）。

IEF可以在自然或变性条件下运行，其基体形成为条带或杆。当分离后要求蛋白质处于其原始状态时，例如，如果要采用活性染色，则首选自然条件。但是天然IEF，许多蛋白质在低离子强度下不可溶，或在接近其PI的pH值下仅部分可溶，这一情况使实验经常受到限制。在这些情况下，应使用变性的IEF。尿素是首选的变性剂，因为这种不带电的化合物可以溶解许多在IEF条件下不溶的蛋白质。

IEF最好使用水平电泳仪进行，因为这样可以非常有效地冷却，这是对抗高电压影响所必需的。

在第一次尺寸分离后，将得到的条带或条带平衡在SDS溶液中，然后应用于SDS-PAGE，在SDS-PAGE中，根据分子量分离蛋白质重量。由于蛋白质是根据两个不同的性质PI和尺寸分离的，在2-D凝胶电泳中分离的功率比其一维对应物大得多。

2-D凝胶电泳作为生化分离技术的能力自引入以来几乎已经被认识到。然而，由于其在蛋白质组学领域的快速发展，它的应用变得越来越重要，因为它具有同时分离数千种蛋白质的出色能力。这项技术还可以检测出PTMS和不能从基因组序列预测到的相互翻译修饰的蛋白质。

除了蛋白质组学外，2-D凝胶电泳的应用还包括细胞分化、疾病标志物检测、治疗监测、药物发现、癌症研究、纯度检查和微量蛋白质纯化。另外，二维蛋白质印迹技术是研究翻译后修饰（PTMS）的一种非常有用的方法。

详细的原理，方法，步骤，信息可以在GE公司的2-D电泳手册(3).中找到。

2-D Electrophoresis, Principles and Methods

聚丙烯酰胺凝胶电泳可供选择电泳很多，不同设备适合不同应用。可选择条件包括凝胶大小和厚度、垂直或 水平取向、预制或实验室配制凝胶、速度和分辨率要求、应用目标和成本考虑。表4列出了通用电气公司提供的仪器。 

垂直或水平电泳系统皆可进行蛋白分离。垂直电泳被更多使用，可选配件较多，灵活性高。简单的搭配，各 种不同尺寸、厚度的凝胶都可进行电泳实验。