【Cytiva】WB样本制备之蛋白提取方案

要获得成功的蛋白质免疫印迹结果，良好的样品制备是非常重要的。通过了解起始样本的性质，并清楚地了解蛋白印迹实验所需的信息，成功分析的可能性就会增加。因此， 本章的重点是样品制备的基本规则，有助于确保分析从一开始就正确进行。有关样品制备的更多详细信息，请参见手册，GE的蛋白质样品制备 (1)。本章的重点是介绍那些对蛋白印迹影响最大的方面。

原则上， 所有蛋白质来源，从单个细胞到整个组织, 以及细胞外基质, 生物液体, 和体外分泌的蛋白质, 都可以通过蛋白质免疫印迹进行分析。然而悬浮液中的哺乳动物细胞等来源在温和的条件下很容易被破坏, 并容易释放它们的蛋白质。而从生长附着于组织或实体肿瘤中的细胞中提取蛋白质则更加困难。植物、细菌和真菌中因周围和保护活细胞的细胞壁，富含碳水化合物且刚性强，而使蛋白质提取变得更加复杂。

不管目标蛋白质的来源如何，实验目的是设计一种具有足够强度的提取实验步骤，以破坏细胞，而不会改变目标蛋白质，同时获得可接受的纯度水平和足够的 蛋白产率。

样本制备——温和！保持低温！

●使用尽可能温和的提取步骤。过度搅拌细胞或组织破坏可能直接使目标蛋白分子变性，形成永久性蛋白复合物，引起化学修饰，或导致裂解的蛋白水解酶的释放。

●在适当的缓冲液存在下，尽可能在冰上快速提取蛋白质，以保持pH、离子强度和稳定性，以防止蛋白质降解。提前预冷装置好设备，并随时将样品放在冰上。

生物材料是复杂的。除了核酸、多糖和脂类之外，目标蛋白很可能是存在于样品中的数千种蛋白之一。这可能会干扰分析。在提取和纯化方面投入的努力取决于最终目标；例如，如果目标是检测低丰度蛋白质，则建议使用诸如免疫沉淀的技术从样品中亲和分离出该特异性蛋白质。另外，几乎天然的样本来源可以完成丰富的蛋白质的分析。但这可能会干扰分析。

提取方法的选择主要取决于样品，以及分析是针对细胞中的所有蛋白质还是仅针对来自特定亚细胞部分的组分。

此外，任何在细胞破裂时释放的内源蛋白酶都可能降解目标蛋白分子。为了尽量避免这些蛋白质损失，在细胞分裂和随后的纯化过程中，应用蛋白酶抑制剂的混合物保护样品。

有许多方法可用于破坏细胞并制备其内容物以用于蛋白质印迹分析。表1列出了一些最通用的提取方法，并指出它们适用于特定细胞或组织源的处理。通常，当样品由易裂解的培养细胞或血细胞组成时尽量采用温和的方法。采用更有力的方法破坏结缔组织中更强壮的细菌或植物细胞或哺乳动物细胞。

表1    列表出不同组织和细胞的提取方案

1、基于去污剂裂解

去污剂裂解是最常用于处理哺乳动物细胞的方法。将细胞悬浮液轻度温和离心，再重悬在含有去污剂的裂解液中。膜被溶解后裂解细胞并释放其内容物。粘附的细胞如成纤维细胞可以通过添加裂解液，直接溶解在组织培养容器表面上。或者可首先使用橡胶刮刀在非溶解性缓冲液的存在下从表面刮除，离心，并作为细胞悬浮液再裂解处理。使用温和的非离子去污剂，如吐温20、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP40)或两性离子去污剂剂，如3-([3-胆碱丙基]二甲基氨)-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)，可使目标蛋白的变性最小化。

2、冷冻/解冻溶解

该方法适用于哺乳动物或细菌细胞的悬浮液。冷冻/解冻的主要优点是简单、成本低。由于冰晶的重复形成，细胞被破坏，通常结合酶解。细胞悬浮液可以用液氮快速冷冻，然后将样品解冻，在室温下在裂解缓冲液中用吸头或轻微涡流再悬浮，重复多次。循环之间，对样品进行离心，保留上清液。

3、渗压震扰

这是一种非常温和的方法，足以在不使用洗涤剂的情况下裂解悬浮的哺乳动物或细菌细胞。这种方法通常与机械破坏相结合，依赖于从高渗透介质到低渗透介质的变化，并且非常适合于裂解液随后被分馏成亚细胞组分的应用。

4、超声波处理

这种蛋白质提取方法最常用于细胞悬浮液。细胞通过插入样品中的探针被高频声波（通常为20至50kHz）破坏。声波产生低压区域，导致探针尖端附近的细胞膜破坏。细胞悬浮液应该在短时间内进行超声波检测，以避免加热，同时样品应该在冰水浴上冷却。此方法适用于小规模样品的制备。蛋白质聚集体（包涵体）都可以被溶解。

虽然相对简单，但超声是一种严格的样品制备方法，其中产生的热量必须持续受到控制，并且敏感的目标分子可能易受剪切力的影响。

对于蛋白质制剂，DNA的释放会导致高粘度的样品难以加工。DNase的加入可以降低粘度。

5、机械方法

可以使用许多粗暴但有效的粉碎和研磨的措施从细胞和组织中提取蛋白质。当样品被迫通过狭窄的间隙时，细胞膜会被液体剪切力破坏；间隙越紧，剪切力越大。液体剪切力可以手动地通过搅拌子均匀化或机械地通过匀浆机来实现。这种温和的方法对于小体积和培养的细胞是较好的。

可以通过使用搅拌器或匀浆机来实现由冷冻缓冲液中的切碎或切碎制备的组织的均匀化。匀浆机不同于搅拌器，它将组织拉成一个包含旋转叶片的长轴。可选不同的容量轴，而样本大小可以低至1毫升。

研钵和杵：组织或细胞通常被冻结在液氮中，并研磨成细粉。氧化铝或砂的加入有助于磨削。细胞壁会被机械力破坏。

玻璃珠研磨：使用细小玻璃珠快速搅拌可破坏细胞壁。珠磨将溶解大部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，包括分枝杆菌。

6、酶消化法

酶法经常使用于从细菌、酵母菌或其他生物膜包被的坚固保护结构组织中提取蛋白质。这些酶溶解细胞壁、外套、胶囊、衣壳或其他不易被机械方法剪切的结构。酶消化通常是在裂解缓冲液中进行均匀化、超声处理或剧烈涡流之中进行。酶法是最常用的细菌和酵母菌。酶法也可用于从嵌入纤维组织的真核细胞中提取蛋白质，其中胶原酶可以增强纤维状胶原的分解。表2提供了酶及其用途的摘要。

表2

7、暴发性减压法

这种技术最常用于细菌、酵母、植物细胞或其他坚固的样品。细胞与惰性气体平衡，如氮气在高压下（通常为5500千帕/ 800磅/平方英寸）。使用弗氏细胞压碎器，当样品从高压室通过孔口转移到低压室中时，这种方法通过快速压降工作。这是一种快速有效的方法，适用于大容量的样本。

8、Premade lysis buffers预裂解缓冲液

GE可以提供一系列的哺乳细胞，酵母细胞，细菌和动物组织蛋白提取试剂。

哺乳动物蛋白质提取缓冲液被设计用于从哺乳动物培养细胞中有效和温和地提取生物活性的总可溶性蛋白。该缓冲液基于有机缓冲剂，可用于细胞悬浮液和粘附细胞。

酵母蛋白提取缓冲试剂盒：可用于从酵母细胞中提取可溶性蛋白，并且是对基于酶解的球状体的制备和提取的专有改进。来自酵母细胞的可溶性蛋白质，在酵母蛋白裂解和提取之前，该试剂盒具有制备球状体和去除裂解酶、酶的实验步骤。该缓冲液是基于含有温和的非离子洗涤剂的有机缓冲剂，和各种盐和试剂的专有组合，以增强蛋白质的提取和稳定性。还提供了一种现成的酶解制剂。根据不同的应用，可以添加其他试剂，如还原剂、螯合剂和蛋白酶抑制剂。酵母蛋白提取缓冲套件无需费力的将酵母细胞用玻璃珠裂解。

9、样本准备试剂盒

样品研磨试剂盒可用于破坏小组织和细胞样品用于蛋白质提取。每管约100毫克的样品仅在10分钟内处理完成。该试剂盒由微离心管组成，每个离心管含有少量悬浮在水中的磨料研磨树脂和一次性杵。首先将管离心，使树脂颗粒和水被除去。然后将选择的提取液和样品加入到管中，并用杵研磨样品。离心后，细胞碎片和研磨树脂牢固地滞留在管的锥形底部，并且上清液很容易被去除。

Siga®TrPyPrEP试剂盒设计用于快速分离和纯化动物组织和哺乳动物细胞的未分化样品中的高产基因组DNA、总RNA和总变性蛋白。实验流程减少了许多步骤，使得在小于1小时内制备所有三种分析物。缓冲区、实验方案确保了从活检、存档组织和肿瘤等有限样本中的高恢复性。

10、Protecting samples 样本保护

蛋白酶抑制剂必须包含在裂解缓冲液中，以防止在细胞裂解过程中内源性蛋白酶释放后的蛋白质降解。

蛋白酶抑制剂混合物：样品制备通常需要蛋白酶活性的抑制。GE提供了竞争性和非竞争性蛋白酶抑制剂的独特组合，它保护了蛋白质在动物组织、植物组织、酵母和细菌纯化过程中的蛋白被水解。多种搭配试剂中含有丝氨酸、半胱氨酸和钙蛋白酶蛋白酶抑制剂，有效地抑制了95%以上蛋白酶活性的。也可以选择加入乙二胺四乙酸(EDTA) 来抑制金属蛋白酶。

虽然在蛋白质提取过程中保持蛋白酶处于非活性状态是重要的（表3），但也应考虑其他潜在的危害性污染物。例如，如果蛋白免疫印迹的目的是检测磷酸化蛋白，那么重要的是保护样品不受磷化酶在样品制备过程中释放到裂解物中的去磷酸化作用。保护样品的一种方法是在裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂，如钒酸钠。也可能需要保护靶蛋白免受不必要的修饰，例如乙酰化、泛素化或糖基化。

表3