【Cytiva】蛋白质免疫印迹原理与方法

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Cytiva

简介

Western blotting（WB），蛋白免疫印迹实验，是蛋白质检测和分析中应用范围最广并被广泛认可的一个技术方法。这个方法建立在：通过固定在膜上的蛋白质与抗体特异性结合建立蛋白复合体，并用各种检测方法检测结合抗体。Western印迹法首次在1979（1）中被描述，现已成为生命科学研究中最常用的方法之一。

蛋白质免疫印迹工作流程

尽管蛋白质免疫印迹实验方法的细节对于各种应用都是多样的，随着适应特定的蛋白质特性和所需的信息水平，它们都遵循一些共同的基本步骤。

例如，目标样品在进行电泳分离之前通常必须经过一定程度的预处理。样品可以包括复杂的蛋白质混合物，例如细胞或组织提取物，但它也可以是纯化蛋白质的样品，例如蛋白纯化过程中的一部分。

将凝胶电泳应用于样品进行蛋白质分离，然后从凝胶中电转移将该蛋白质固定在膜上。在膜上没有发生蛋白结合的区域进行封闭，以防止在下一步与一抗的非特异性结合。该膜与一抗一起孵育，一抗与目标蛋白质特异性结合。通过洗涤除去未结合的抗体，并且使用与酶、荧光团或同位素结合的二抗进行检测。蛋白质:抗体:抗体复合物的检测信号与膜上蛋白质的量成正比。

最常用的检测方法是化学发光法。基于二抗结合的辣根过氧化物酶（HRP），通过加入过氧化物试剂，该酶催化其氧化鲁米诺形成发光。光信号可以通过使用基于电荷耦合器件(CCD)相机的成像仪或者通过用X射线胶片曝光来捕获。

一种较新的检测方法是荧光法。二抗用荧光标记, 如 CyDye™。可以使用激光扫描仪或配备适当光源和滤光片的CCD成像仪，直接检测荧光信号。使用荧光对目标信号进行归一化更为可靠, 因为在同一印迹上可以采用多通道对目标蛋白和对照蛋白进行检测。

GE与蛋白质印迹实验

自1990年推出首款用于蛋白质免疫印迹的增强化学发光 (ECL™) 检测试剂 (Amersham®ECL) 以来, GE提供的产品组合已在所有蛋白质免疫印迹要求中得到了改进和优化。将电泳和传输设备优化成为高灵敏度的检测系统和软件。

从GE 产品组合中选择最佳凝胶、膜、分子量标记蛋白、封闭试剂、二抗、检测试剂、成像系统和软件, 轻松实现卓越的效果。

Fig 1.1. GE提供了一系列的设备以实现高效的蛋白质印迹实验。

参考文献

1. Towbin, H. et al. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 76, 4350–4354 (1979).

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