【Promega】蛋白：蛋白相互作用检测方法

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promega NanoBRET PPI System N1811 N1821 N1661 N1662 N1663 N1581

了解蛋白功能的关键在于了解细胞内蛋白相互作用。但是，监测活细胞内蛋白：蛋白相互作用以及这些相互作用的变化具有一定挑战性。

由于 NanoLuc 萤光素酶具有明亮的发光信号且分子量较小，因此用于生物发光共振能量转移（BRET）或互补报告基因方法检测蛋白相互作用的灵敏度较高。本文重点阐述的 NanoBRET 和 NanoBiT 技术可在内源性表达水平检测活细胞内蛋白相互作用。

NanoBRET PPI System

NanoBRET System 是一种基于蛋白接近程度的检测技术，通过测量从生物发光蛋白供体至荧光蛋白受体的能量转移并计算NanoBRET 比值来检测特定蛋白对的相互作用。NanoBRET System 使用优化的蓝移 NanoLuc® 融合蛋白作为能量给体，并使用红移 NanoBRET 618 荧光团标记的 HaloTag® 融合蛋白作为能量受体，其信号检测窗口 >150nm，分辨率更高。

NanoLuc 的信号明亮度是其他 BRET 萤光素酶供体的 30 倍。发生 NanoBRET 转移时，NanoLuc 和 HaloTag 618 配体紧密靠近彼此（≤10nm）。

使用此检测试剂盒以及生理水平表达的全长蛋白可实现蛋白相互作用的诱导和抑制的实时检测。

NanoBRET™检测方法（图A）发生蛋白相互作用时，从NanoLuc® -蛋白A融合蛋白（能量供体）至荧光标记的 HaloTag® - 蛋白 B 融合蛋白（能量受体）的能量转移图示。（图 B）NanoLuc®发射光谱信号（460nm）和荧光 HaloTag® NanoBRET™ 配体发射光谱信号（618nm）的光谱分离，以及 NanoBRET™ 比值的计算。

NanoBRET PPI Assay

了解真实的生物学机制

• 使用与活细胞兼容的试剂获取实时数据

• 检测低表达水平

• 使用全长蛋白或片段。

灵活、耐用且可扩展从而满足您的特定需求

• 高通量，可与 96 孔板或 384 孔板兼容

• 检测变异性小且重现性好

• 检测蛋白相互作用的诱导和解离

• 在活细胞中筛选小分子物质。

预制 NanoBRET PPI 检测试剂盒

产品目录中提供了预制、优化后 NanoBRET PPI 检测试剂盒或其作为定制检测材料予以提供，适用于一系列蛋白质家族，包括：

• 溴结构域 / 组蛋白和其他表观遗传靶标

• 转录蛋白检测试剂盒

• 信号蛋白和激酶检测试剂盒

• 膜蛋白检测试剂盒

预制检测试剂盒包含优化后载体、PPI 阳性对照载体对（p53/MDM2）、检测方案和可于 96 孔板模式进行 400 次检测或可于 384 孔板模式进行 1000 次检测的足量试剂等组分。若需获取更多信息以及是否可购买，请访问：www.promega.com/NanoBRET

NanoBRET PPI Starter System

NanoBRET PPI Starter System 包含您自建检测方法的所有组分。NanoBRET PPI Starter System 随附用于制备表达靶蛋白与NanoLuc 萤光素酶或 HaloTag 标签融合蛋白的载体，以及可进行 200 次检测的足量检测试剂。

选择 NanoBRET PPI MCS Starter System，使用传统的克隆方法将靶蛋白插入对应载体的多克隆位点（MCS），以制备 N 末端和 C 末端与 NanoLuc 萤光素酶和 HaloTag 标签融合的靶蛋白。

选择 NanoBRET PPI Flexi® Starter System 并使用 Flexi Vector Cloning System 制备 N 末端和 C 末端与 NanoLuc萤光素酶和 HaloTag 标签融合的靶蛋白。此方法为基于 2 种稀切限制性内切酶（Sgfl 和 Pmel）的定向克隆方法，可保证不同 Flexi Vector 转移蛋白质编码区过程中的高保真度且无需重新测序。Find My Gene™ 服务包括多种已制备好的 ORF 克隆体（Flexi 模式），以帮助您更简单的获得融合蛋白。

NanoBRET 阳性对照

NanoBRET 阳性对照包括转染运载体 DNA 和编码 NanoLuc-HaloTag 融合蛋白的载体（将 NanoLuc 供体和 HaloTag 受体连接在一起，从而确保能量有效转移）。对照载体可在设置仪器时用作阳性信号对照或可在进行其他 NanoBRET 检测时用作参比对照。

若需进行 NanoBRET PPI 检测，则需使用可连续测量双波长窗口的微孔板读数仪（例如 GloMax®Discover 仪器）。

NanoBRET PPI Positive Control Pair

NanoBRET PPI Control Pair （p53，MDM2）为一对优化后载体，适用于使用 NanoBRET 检测试剂盒测量蛋白伴侣 p53 和 MDM2之间的相互作用。p53/MDM2 蛋白对可产生较强的 NanoBRET 信号，可于进行仪器设置时使用或在进行其他NanoBRET PPI 检测时用作参比对照对。

p53/MDM2 NanoBRET™PPI Control Pair 的代表数据。图 A. 特异性抑制剂 Nutlin-3 的量效曲线（DRC）图 B 和图 C. 96 孔模式（图 B）和 384 孔模式（图 C）的单次给药测量值和 Z 因子计算。数据生成通过配备 450nm/8nm BP 和 600nm LP 滤波器的 GloMax® Discover System 完成。