【Promega】E. coli S30 Extract System for Linear Templates
描述
E. coli S30 Extract System for Linear Templates 可实现线性 DNA 模板的成功转录 / 翻译。进行操作时，仅需要提供含有原核生物大肠杆菌样启动子的线性 DNA（例如 lacUV5、tac、λPL（con）和 λ-PR）即可。此外，需要具有核糖体结合位点来指导体外蛋白质的合成过程。从缺乏大肠杆菌启动子的 DNA 模板中体外生成的 RNA 也可用于该系统，但蛋白质产量将下降到从线性DNA 模板中产生的蛋白质产量的 1-10%。
反应原理
S30 Extract for Linear Templates 使用大肠杆菌 B 菌 株
（SL119）予以制备，其不具有 OmpT 内源蛋白酶、lon 蛋白酶和核酸外切酶 V（recBCD）。蛋白酶活性的缺失会导致表达蛋白的稳定性更高。与先前描述的核酸酶缺失、recBC 来源的 S30 提取物相比，SL119 菌株的 recD 突变可产生活性更高的 S30 Extract for Linear DNA。但是，S30 Extract for Linear Templates 的活性低于 S30 Extract System for Circular DNA。使用所提供的萤光素酶检测试剂（Luciferase Assay Reagent）进行易于操作的、非放射性的阳性对照反应，可检测使用线性模板的E. coli S30 System 中的萤光素酶基因表达水平。对照反应可产生长达数分钟的高光输出，同时研究人员可从多种检测方法中进行选择，包括进行较为直观的发光信号可视化观察。
功能和优点
• 灵活：可以使用多种模板：DNA 片段、PCR 合成的 DNA、连接的重叠寡核苷酸、体外生成的 RNA 和原核 RNA。
• 完整：包含转录 / 翻译偶联的的所有必要组分。
• 优化：预混液针对每批 S30 提取物进行了优化。
• 对照 DNA：使用（包括）萤光素酶检测试剂（Luciferase Assay Reagent）轻松检测萤火虫萤光素酶表达。
通过 SDS-PAGE 进行蛋白质分析，随后进行荧光显影（曝光 45 分钟）。
将每种 50µl 反应混合液的 5ul 加入每个泳道。
泳道 1 显示由 2µg pBESTluc ™ DNA 合成的蛋白质产物，用 Xho I线性化。全长萤光素酶在 60kDa 迁移，β- 内酰胺酶在 31.5kDa 迁移。明显的内部翻译开始导致 48kDa 的第二个主要基因产物。
泳道2 显示 S30 反应（含有 4µg Cla I-digested pBESTluc™ DNA）的蛋白质产物。一种缺少 10kDa 天然萤光素酶羧基末端的截短萤光素酶多肽符合预期。还要注意，所有由推测的内部翻译产生的微弱蛋白质都在比泳道3少 10kDa 的位置开始迁移。
泳道 3 显示了从 PCR 产生的DNA合成的蛋白质产物（引物用于产生包含 Hind III 至 Xho I 区域的 pBESTluc ™ DNA 的 PCR 产物）。
泳道 2 和 3 中的微弱条带（泳道 1 中不存在）显然是由内部翻译起始点引起的，当将过量的 DNA 添加到 S30 系统中就会显现出来。通过Western blot 分析，这些条带被显示为截短的萤光素酶。
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