【Promega】基于 mRNA 的翻译系统

无细胞翻译系统用于体外转录的mRNA或从组织或细胞分离的mRNA的蛋白质表达。这些系统用于在高通量应用（例如显示技术）中表达单个蛋白质以及多个蛋白质。此外，无细胞翻译系统可用于功能和结构 RNA 分析，或研究翻译机制的各个方面。真核翻译系统来源于兔网织红细胞裂解物（RRL）或小麦胚芽提取物（WGE）。我们提供三种基于 mRNA 的翻译系统。用微球菌核酸酶处理提取物以破坏内源性 mRNA，从而将背景翻译降至最低（表 3.2）。

Flexi® Rabbit Reticulocyte Lysate System（Flexi® 兔网织红细胞裂解物系统）通过允许针对各种参数（包括 Mg2+ 和 K+ 浓度）优化转化反应，在反应条件下提供了更大的灵活性。小麦胚芽提取物是 RRL 系统的有用的替代选择，可用于表达小蛋白质或表达已知在 RRL 中含量丰富的蛋白质。目前从植物、酵母或其他真菌中表达蛋白质的研究人员，也可能发现 Wheat Germ Extract 比 RRL 更合用。

Overview of Cell-Free Translation Systems that use mRNA as a Template

表 2.

* 裂解物提供有三种氨基酸混合物，用于掺入标记的氨基酸，如蛋氨酸、半胱氨酸和亮氨酸。Transcend™ tRNA (Cat.# L5070；L5061) 和FluoroTect™ （Cat.#L5001）可用于掺入生物素化或荧光标记的赖氨酸残基。

** 该系统提供比标准兔网织红细胞裂解物系统更大的反应条件灵活性。Flexi® Rabbit Reticulocyte Lysate System (Flexi® 兔网织红细胞裂解物系统 ) 允许针对各种参数优化翻译反应，包括 Mg2+ 和 K+ 浓度以及添加 DTT 的选项。

Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL),Nuclease-Treated，通过添加几种补充剂优化 mRNA 翻译。其中包括血红素，它阻止血红素调节的 elF-2a 激酶的激活;由磷酸肌酸激酶和磷酸肌酸组成的能量产生系统;小牛肝脏 tRNA，以平衡内源的 tRNA 群体，从而优化密码子的使用并扩大可有效翻译的 mRNA的范围。此外,用微球菌核酸酶处理裂解物以消除内源性 mRNA。RRL通过磷酸化乙酰化和异戊二烯化对蛋白质进行翻译后修饰。信号肽裂解和核心糖基化也可以通过添加犬胰腺微粒体膜来实现。

在 RRL翻译反应中，mRNA 被用作翻译的模板。一般而言在 30°C下孵育 1.5 小时后将获得最佳结果。然而，许多与模板相关的因素影响翻译效率并且在设计体外翻译实验时应考虑。

特定转录物的最佳 mRNA 浓度会有所不同，应根据经验确定，此外，某些核酸序列元素的存在可以对起始保真度和翻译效率产生深远影响。Poly(A)+尾、5-帽、5-未翻译区域和AUG 起始密码子(或序列中的次要 AUG)周围的序列上下文都可能影响给定 mRNA 的翻译。

●一致性:每个批次的可靠和一致的翻译。

●经过优化，易于使用:经处理的兔网织红细胞裂解物为翻

译而优化。

●方便:包括萤光素酶阳性对照 RNA.

图3.使用兔网织红细胞裂解物的体外翻译简要流程图。

Flexi® Rabbit Reticulocyte Lysate System 广泛用于鉴定 mRNA 种 类 和 表 征 其 产 物。相 比 于 Rabbit Reticulocyte Lysate,Nuclease-Treated，Flexi® Rabbit Reticulocyte Lysate System（目录号：L4540）提供了更加灵活的反应条件，通过对翻译反应在广泛的参数范围进行优化（包括 Mg2+ 和 K+ 浓度）。

与标准的 Rabbit Reticulocyte Lysate 一 样，Flexi® Rabbit Reticulocyte Lysate System 通过添加以下补充物来优化翻译：其中包括血红素，可防止对起始因子 eIF-2α 的抑制；由预先测试的磷酸肌酸激酶和磷酸肌酸组成的能量再生系统；小牛肝 tRNA，可平衡内源性的 tRNA 群体，从而优化密码子的使用，并扩大可有效翻译的 mRNA 范围；以及微球菌核酸酶消除内源性 mRNA，从而减少背景翻译。据报道，该真核系统通过磷酸化、乙酰化和异戊二烯化对蛋白质进行翻译后修饰。添加犬胰腺微粒体膜（Canine Pancreatic Microsomal Membranes）后，可发生信号肽切割和核心糖基化。相比于标准的 RRL 系统，Flexi® Rabbit Reticulocyte Lysate System提供更加灵活的反应条件。

• 一致性：每个批次的可靠和一致的翻译。

• 易于优化：为了帮助优化镁浓度，为每批 Flexi® Lysate 提供了内源性镁浓度。

• 方便：包括萤光素酶阳性对照 RNA 和检测试剂。

来自标准的（泳道1-5）或Flexi® Lysate（泳道6-10）反应的样品在4-15%梯度 SDS 聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，并通过放射自显影进行分析。

每 50µl 反应包含 1µg RNA、20µCi[35S] 蛋氨酸和 Amino Acid Mixture Minus Methionine。反应在 30℃下孵育 90 分钟。翻译反应用以下质粒构建体产生的五种不同 RNA 进行：

泳道 1 和 6，pPOLY(A)-luc；

泳道 2 和 7，B13 (CAT)；

泳道 3 和 8，B38 (CAT)；

泳道 4 和 9，c-jun ( 转录因子 )；

泳道 5 和 10，pEMCV UTR luc。

泳道 11 包含 [14C] 分子量标准品。

萤光素酶产物的两种检测方法如下所示：以相对光单位 (RLU) 测量的发光 (2.5µl 翻译体系 +50µl Luciferase Assay Reagent，10 秒整合 )和 [35S] 蛋氨酸的掺入百分比 ( 通过 0.5µl 翻译反应的 TCA 沉淀确定 )。