【Promega】NanoBRET™ Target Engagement（TE） Assay

对小分子结合并调控靶蛋白活性的研究对理解生物学和治疗疾病至关重要。生物发光共振能量转移（BRET）技术的应用使得在活细胞内定量检测一个小分子和蛋白之间的相互作用成为可能。某些情况下，这一方法甚至可以实时检测化合物与靶蛋白相互作用，不仅能研究相互作用的形成，且能研究其分离。

Target engagement (TE) assay 检测完整细胞中化合物与靶标的结合。该检测系统还能提供化合物-靶点滞留时间的信息，并可用于筛选抑制剂并比较其 IC₅₀值。

●NanoLuc® 萤光素酶与 BRET 技术

蛋白相互作用检测依赖能量从作为 BRET 供体的标记蛋白的萤光素酶转移到作为 BRET 受体的另一荧光标记的配体上。能量的转移受两者接近程度的调控。作为BRET 供体的 NanoLuc® Luciferase，由于其光信号非常强、蛋白分子小，因而具有独特的优势。NanoLuc®Luciferase 可使用多种荧光基团作为 BRET 受体。

●NanoBRET™ 技术

是大幅度改良的 BRET （Bioluminescence ResonanceEnergy Transfer，生物发光共振能量转移 ）分析平台，可在活细胞内研究蛋白：蛋白相互作用。该技术使用NanoLuc® 萤光素酶作为能量供体，NanoBRET™ 618 荧光基团标记的 HaloTag® 融合蛋白作为受体的明亮的蓝移发光信号耦合到远红移的 HaloTag® 受体上后，光谱叠加更佳、信号更强、且与传统 BRET 分析相比背景更低。

系统中 NanoBRET™ tracer 可以透过细胞膜，进入细胞与 NanoLuc®- 靶点融合蛋白相互作用产生 BRET 现象当待测药物与靶点蛋白存在相互作用时，由于药物与 Tracer 竞争结合靶点，BRET 信号减弱。

通过 NanoBRET™ TE 检测系统可以检测活细胞水平的药物与靶点的亲和力以及药物膜通透性。

NanoBRET™ TE Assay适用于多种靶蛋白，包括激酶、HDAC、BET BRD和GPCRs。为评估药物在活细胞中的亲和力、透膜性和药物-靶点相互作用的滞留时间提供了一种灵敏的方法，更高的信噪比，数据更加可靠可重复，以获得更多的生理相关信息。

1、活细胞水平的相互结合检测

2、可监测化合物 : 靶标滞留时间

3、蛋白表达水平更接近内源蛋白

4、更好的信噪比，数据更加可靠可重复

5、适合高通量筛选 , 兼容 96、384 孔板

6、超过300 种激酶及其他靶标融合蛋白载体供选择

●检测化合物对靶标的亲和力和选择性

应用可透细胞膜的NanoBRET™Tracer，通过竞争性结合检测方式检测受测化合物对靶标的亲和力和选择性，细胞内亲和力的直接定量检测。分析受测化合物的 target engagement，以接近 NanoBRET™ Tracer 量效曲线的EC50 值的固定浓度的 NanoBRET™ Tracer 处理细胞。为了确定受测化合物的亲和力，在固定浓度的 NanoBRET™Tracer( 通常是 EC₅₀-EC₈₀) 存在下，细胞以不同浓度受测化合物处理。

●检测化合物的细胞滞留时间

滞留时间分析是通过示踪剂 Tracer 竞争引起的化合物离解动力学分析来测定。将细胞与接近饱和剂量的受试化合物（例如IC80）孵育，该化合物能够与目标 NanoLuc® 融合蛋白结合。去除未结合的受试化合物，然后加入 NanoBRET™ Tracer 和检测试剂。通过对 NanoBRET™ 信号的动力学检测评估化合物的滞留时间。

在加入示踪剂 Tracer 后，加入滞留时间短的化合物将导致BRET 信号的快速增加，共价结合 / 不可逆结合或长滞留时间的化合物的 BRET 信号将随时间缓慢 / 逐渐增加。

●应用举例

检测化合物在活细胞中的细胞亲和力和滞留时间，可以提供一个更完整的化合物与激酶结合的图像。此应用举例使用了NanoBRET™ TE ABL1 kinase assay 和几种针对慢性粒细胞白血病的药物 (CML)。与第二代药物 Dasatinib 和第三代药物Ponatinib 相比，第一代 CML 药物 Imatinib 表现出弱结合和更短的滞留时间。Ponatinib 与 Dasatinib 的亲和力相似，但是滞留时间更长。

●应用文献

1. Asquith, C.R.M. et al. Identification and Optimization of 4-Anilinoquinolines as Inhibitors of Cyclin G Associated Kinase. ChemMedChem (2018) 13(1), 48-66..

应用产品：

• FuGENE® HD Transfection Reagent

• GloMax® Discover System

• NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay, K-5

2. Ferguson, F.M. and Gray, N. Kinase inhibitors: the road ahead, epub ahead of print. (2018)

应用产品：

• NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay, K-5

• NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Detection Reagents, K-5

• NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay, K-4

• NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Detection Reagents, K-4

3. Vasta JD, Corona CR,WilkinsonJ ,et al.. Quantitative,Wide-Spectrum Kinase Profiling in Live Cells for Assessing the Effect of Cellular ATP on Target Engagement.Cell ChemBiol. (2018) 25(2):206-214.

应用产品：

• NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay, K-5

• NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay, K-4

• NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Detection Reagents, K-5

• NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Detection Reagents, K-4

• NanoBRET™ Nano-Glo® Substrate

• GloMax® Discover System

●操作流程

Target Engagement 亲和力检测与滞留时间检测简要操作流程

注：如需稳转细胞，请咨询 Promega

Target Engagement 的 ADH(Adherent Format) 检测和 NBS(Nonbinding Surface) 检测模式简要操作流程

NanoBRET™ TE Assay 亲和力检测简要流程及对应产品工具