【Merck】RIP优化和故障排除

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Merck 免疫沉淀 Millipore RIP

步骤：免疫沉淀
可能的问题	实验建议
抗体无法免疫沉淀RIP裂解产物中的蛋白	●在RIP分析之前，采用IP蛋白质印迹法，确证这种抗体可以使目的RBP免疫沉淀。 ●选择针对抗原不同表位的抗体。 ●如有可能，使用Merck Millipore RIPAb+验证抗体。 ●采用固定量的RIP裂解产物，用抗体稀释系列进行免疫沉淀，或反之。 ●将4℃下目的抗体与RIP裂解产物的培养时间延长至过夜。 ●确证抗体同种型与蛋白A或G的免疫沉淀相容。不推荐这种试剂盒用于IgM或鸡IgY抗体。
免疫沉淀中的磁珠量不足	●随着时间推移，磁珠沉淀于离心管底部。在取出适当体积进行免疫沉淀之前，确保磁珠混匀。 ●当使用真空抽吸器时，小心抽取磁珠；使用高强度钕磁力架，如Merck Millipore目录号20-400 MagnaGrIP Rack。
步骤：RNA纯化
蛋白酶K消化不完全	当进行蛋白酶K消化时，确保温度设置为约55℃。高于65℃温度长时间培养会使蛋白酶K灭活。
较差的A260/A280比	●当采用苯酚:氯仿和氯仿提取DNA时，避免中间相。 ●在Bioanalyzer或Experion仪器上，检测裂解产物input中提取的RNA，评估其中是否存在核糖核酸酶。
较低RNA产率	●大多数RNA结合蛋白免疫沉淀不会产生可检测量的RNA。但是采用RT- PCR，可以检测到低于毫微克量的RNA。 ●如果在cDNA合成后没有检测到RNA，考虑上述免疫沉淀故障原因。
RNA降解	●参考本方案的推荐——在溶液中使用核糖核酸酶抑制剂。不得引入核糖核酸酶，确保工作环境中不含核糖核酸酶。方案实施时，遵照核糖核酸酶对照品指南。 ●使用核糖核酸酶灭活试剂，以确保工作区和物料不含核糖核酸酶。
没有检测到任何RNA	●延长-80℃下乙醇沉淀的培养时间。 ●有时，RNA乙醇沉淀物非常少。当取出上清液时，确保没有吸取RNA沉淀物。 ●在RIP分析之前，采用IP-蛋白质印迹法，确证这种抗体可以使目的RBP免疫沉淀。
步骤：RT-PCR
无PCR产物	●不同程度增加PCR反应中的cDNA量。 ●增加扩增反应的周期数。 ●确保在PCR仪上正确设置扩增反应程序。 ●再次检查引物是否有正确的Tm。 ●对来自总RNA(或input RNA)的cDNA进行●PCR，以确保扩增条件能够获得与预期大小一致的DNA产物。 ●在RIP分析之前，采用IP-蛋白质印迹法，确证这种抗体可以使目的RBP免疫沉淀。
较高背景水平	在免疫沉淀后洗涤不足。增加洗涤磁珠的次数。通过增加氯化钠、SDS 、脱氧胆酸或离散剂( 如尿素) 的最佳测定浓度(1~3M)，可达到更为严格的洗涤。但是应更加小心，以确保抗体或靶标RBP不受严格洗涤条件的影响。
PCR产物弥散	●不同程度地减少加至PCR反应中的cDNA量。 ●使用Hot Start Taq聚合酶，以避免引物的非特异性退火。
自SNRNP70和正常兔IgG IP获得的PCR产物之间的量没有差异	●确保免疫沉淀使用了正确量的抗体和正确的RIP裂解产物。 ●降低加至PCR反应的cDNA量。 ●减少分析cDNA的周期数。重要的是，PCR产物是在PCR线性扩增阶段中分析的，其中可以测定启动DNA数量之间的差异。 ●采用IP-蛋白质印迹法，确保这种抗体可使SNRP70成功免疫沉淀。