【Merck】Duolink™ PLA®流式细胞分析实验方案

原理

Duolink^™采用PLA专业技术，通过一抗、二抗、DNA滚环复制，可将蛋白信号放大1000倍，实现单分子级别的灵敏度。即便是微量样本、微弱互作、极罕见的低丰度表达，也能在内源水平可视化研究蛋白的互作、定位和定量。

应用

蛋白互作

蛋白质互作形成的复合体在许多重要的生物学过程中起着决定性的作用，例如DNA复制、转录、翻译、剪接、分泌、细胞周期控制、信号转导和中间代谢等。蛋白质自身的作用和活性通常会由于与其他蛋白质的互作而改变。了解疾病通路是研究蛋白质如何与细胞的各种成分发生互作的根本出发点。无论蛋白质互作是瞬时的还是稳定的，测量这种变化都是至关重要的。使用Duolink^TM可以让你对稳定、微弱及瞬时的内源性蛋白质相互作用进行可视化研究。

翻译后修饰

蛋白质间的相互作用往往依赖一种或两种蛋白质的修饰状态。翻译后修饰是指蛋白质在核糖体中翻译完成之后，在蛋白质合成过程中的共价及酶促修饰过程。涉及到调节功能和结构蛋白质组学研究的翻译后修饰过程包括：磷酸化、糖基化、酰化、硫酸盐化及泛素化。对翻译后修饰进行历史性分析需要用到多种技术，包括：凝胶电泳、质谱、高效液相色谱法和免疫组化。Duolink^TM技术使您能够在固定的细胞和组织中，对内源性修饰过程进行可视化的研究。

低丰度蛋白质

在真实的疾病生物学研究中，对天然状态的蛋白质进行研究至关重要。然而，给定样品中的蛋白质浓度会有一个宽动态变化范围。传统的做法是，如果需要在天然状态下对蛋白质进行研究，必需对目的蛋白质进行过表达、标记或遗传修饰。使用Duolink^TM可以让你对单个蛋白质或蛋白质互作的内源表达水平进行检测。

蛋白质定位

蛋白质定位涉及蛋白质在细胞中存在位置的计算预测。在亚细胞水平了解蛋白质的定位，有利于更好地了解蛋白质

功能、蛋白质相互作用机制，以及细胞信号转导通路。研究内源蛋白质定位的传统技术经常会出现脱靶结合及与其他蛋白质的交叉反应。Duolink^TM能够利用二抗系统，提高目的蛋白质的识别特异性和灵敏性。

数字化定量

对细胞和组织图像均可进行分析。大多数显微镜软件和其他免费软件（如BlobFinder、Image J、Cell Profiler等）均可用来分析PLA数据。通过细胞核自动检测和细胞质尺寸估计等功能，可对组织或细胞群体的表达水平进行单细胞统计分析。

流式细胞术

流式细胞术是一种出色的细胞群分析方法。Duolink^TM PLA®检测试剂盒具有灵敏的蛋白质、蛋白质互作和蛋白质修饰检测功能，可实现更出色的细胞群分析。Duolink^TM flowPLA 实验需要固定的悬浮细胞、两种可分别识别目标蛋白的一抗、一对PLA探针（一个PLUS和一个MINUS）、清洗液以及Duolink^TM flowPLA检测试剂盒。flowPLA试剂盒具有多种不同荧光染料：Red、Green、Orange、Violet或FarRed。

材料和设备

本实验方案描述了如何利用Duolink^TM PLA®试剂以通过流式细胞术检测细胞群内的单一蛋白质、蛋白质修饰和蛋白质互作的方法。

Duolink^TM PLA^®试剂

Duolink^TM PLA®流式细胞术实验需要使用以下Duolink^TM PLA®产品：

• Duolink^TM PLA®探针（不同物种的PLUS 100RXN和MINUS 100RXN探针各一份，对应一抗宿主物种）。

每个探针试剂盒包括：

 ◊ PLA探针(5x) - PLUS和/或MINUS，具体取决于产品。

 ◊ 封闭溶液 - 用于在抗体孵育之前封闭样品。

 ◊ 抗体稀释液 - 用于稀释PLA探针；必要时还可稀释一抗。

•Duolink^TM flowPLA检测试剂（绿色、橙色、红色和深红色可选）。每个检测试剂盒包括：

◊ Po连接储液(5x) - 配制1x连接缓冲液的稀释液。

 ◊ 连接酶(1 U/μL) - 配制连接溶液时加入。

 ◊ 扩增储液(5x) - 配制1x扩增缓冲液的稀释液。

 ◊ 聚合酶(10 U/μL) - 配制扩增溶液时加入。

 ◊ 检测储液(5x) - 配制1x检测缓冲液的稀释液。

其他必需材料

• 检测目标蛋白质的一抗。配合Duolink^TM PLA®探针使用时，必须源自小鼠、兔或山羊。

• 高纯水（无菌过滤，Milli-Q®或类似级别纯水）。

• 悬浮细胞样品，经固定、修复和透化预处理。

• 1x PBS (P3813)

设备

• 流式细胞仪，配有适当的滤光片和数据分析软件。

• 37°C培养箱。

• 冷藏盒（酶用）。

• 移液器和吸头（1μL至1000μL）。

• Eppendorf管，U型底或V型底96孔板。

• 可选：96孔滤板或滤杯(Millipore UltraFree MC-HV)，孔板摇床。

以下实验方案适用于检测100µL反应体积（1,000细胞/µL）中最多100,000个细胞的情况。此体积可根据样品中细胞的数量调整。所有培养均应在37°C培养箱中进行。所有洗涤步骤均应在室温下进行。

Duolink^TM洗涤缓冲液和1x PB应在实验开始前制备， 制备方法：将一袋组分溶于高纯水， 至终体积1000 mL。1x PBS可室温储存。洗涤缓冲液可室温短期储存（两周内），或4°C长期储存。

许多Duolink^TM PLA®试剂以浓缩储液形式提供，应在临用前稀释。稀释后的Duolink^TM PLA®试剂不可储存。

首先，应对悬浮细胞样品进行固定和透化预处理。可固定、透化并在大包装溶液中封闭将细胞，然后将其等分到试管或孔中进行Duolink^TM PLA®染色——除非这些步骤有特殊条件规定。

● 封闭

◊固定和透化后，离心并从细胞中去除洗涤缓冲液。

◊每1uL细胞沉淀使用10uL Duolink^TM封闭液 (1滴约30uL)

◊在37°C培养箱中孵育60分钟。

● 一抗孵育

◊利用Duolink^TM抗体稀释液或适当的抗体稀释液将一抗或其它抗体稀释至适宜浓度

◊采用U型底或V型底孔板分装细胞，每孔100,000个细胞

◊将孔板400xg离心5分钟，然后从细胞中去除Duolink^TM封闭溶液。

◊将一抗溶液添加加入各样品中并充分混匀。

◊针对一抗选择最佳的孵育温度和时间，孵育孔板。

● Duolink^TM PLA 探针育

◊按1 :5的稀释度，用Duolink抗体稀释液稀释PLUS和MINUS PLA探针。100uL反应须取20uL PLA探针MINUS储液.

◊20uL PLA探针PLUS储液和60uL抗体稀释液。须为所有样品配制足量溶液。

◊400 xg离心5分钟，然后从细胞中去除溶液。

◊每孔用200uL DuolinkM洗涤缓冲液洗涤细胞两次，400xg离心5分钟，然后从细胞中去除溶液

◊添加PLA探针溶液并混匀。

◊在37°C培养箱中孵育1小时。

● 连接

◊涡旋5x Duolink^TM连接缓冲液。

◊ 按1 :5的稀释度，用高纯水稀释5xDuolink^TM连接缓冲液并混匀。100μL反应须取20μL 5x连接缓冲液加入77.5 μL高纯水。须为所有样品配制足量溶液。

◊ 400xg离心5分钟，然后从细胞中去除溶液。

◊ 每孔用200µL Duolink^TM洗涤缓冲液洗涤细胞两次， 400xg离心5分钟，然后从细胞中去除溶液。

◊ 洗涤期间，利用冷冻修复模块(-20°C)复苏从冰柜取出的聚合酶。

◊ 按1:40的稀释度，100μL连接溶液须取2.5 μL连接酶加入97.5 μL 1x连接缓冲液。

◊ 加入连接溶液并混匀。

◊ 在37°C培养箱中孵育30分钟。

● 扩增

◊ 涡旋5x Duolink^TM扩增缓冲液。

 ◊ 按1:5的稀释度，用高纯水稀释5x扩增缓冲液并混匀。100µL反应须取20μL 5x扩增缓冲液加入78.75μL高纯水中。须为所有样品配制足量溶液。

 ◊ 400xg离心5分钟，然后从细胞中去除溶液。

 ◊ 每孔用200µL Duolink^TM洗涤缓冲液洗涤细胞两次， 400xg离心5分钟，然后从细胞中去除溶液。

 ◊ 洗涤期间，利用冷冻修复模块(-20°C)复苏从冰柜取出的聚合酶。

 ◊ 按1:80的稀释度，聚合酶添加到1x扩增缓冲液中并混匀。100μL扩增溶液须取1.25μL聚合酶加入98.75μL 1x扩增缓 冲液中。

 ◊ 加入扩增溶液并混匀。

 ◊ 在37°C培养箱中孵育100分钟。

 ◊ 涡旋5x检测缓冲液。

 ◊ 按1:5的稀释度，用高纯水稀释并混匀。100µL反应须取20µL 5x检测缓冲液加入80µL高纯水中。须为所有样品配制足量溶液。

 ◊ 400xg离心5分钟，然后从细胞中去除溶液。

 ◊ 每孔用200µL Duolink^TM洗涤缓冲液洗涤细胞两次，400xg离心5分钟，然后从细胞中去除溶液。

 ◊ 加入检测溶液并混匀。

 ◊ 在37°C培养箱中孵育30分钟。

● 末次洗涤

 ◊ 400xg离心5分钟，然后从细胞中去除溶液。

 ◊ 每孔用200µL Duolink^TM 洗涤缓冲液洗涤细胞，400xg离心5分钟，然后从细胞中去除溶液。

 ◊ 按约1,000个细胞/µL的密度将细胞重悬于1xPBS中。

流式细胞仪设置

• 采用适当的仪器设置执行流式细胞分析。在运行实验之前，建议针对固定、未染色细胞（即无Duolink^TM PLA®步骤）各单独细胞系的优化仪器设置。确定最佳参数后，对于实验中的所有样品应使用同一设置。可使用前向和侧向散射参数对固定细胞设门并去除细胞碎片。也可通过使用侧向散射宽度或面积-高度参数对黏连体设门。

• 技术性阴性对照应包括分别缺失某一种及缺失所有一抗的情况。这些对照将分别用于测定每种一抗和Duolink^TM PLA®探针的非特异性结合。但请谨记，相对于固定、未染色细胞，阴性对照(如，无一抗但包含PLA探针)可能具有更高的背景荧光。可以使用技术性阴性对照（如，无一抗但包含PLA探针）为基线Duolink^TM PLA®荧光测量值设门，并应用于所有实验样品。

流式细胞分析

图3.延长Duolink^TMPLA® 实验扩增时间可帮助流式细胞仪检测低丰度蛋白质靶标。利用Duolink^TMPLA®技术检测EZH2介导的组蛋白H3上的K27三甲基化（H3K27me3）。A)扩增100分钟后，通过荧光显微镜检测到DU145细胞核（蓝色）几乎没有PLA信号（红色）。采用FITC-鬼笔环肽染色的肌动蛋白（绿色）作为复染剂。B)延长扩增时间增强了常规流式细胞仪对低丰度蛋白质活动（例如EZH2-H3K27me3互作）的检测。C) 将Duolink^TMPLA®与成像流式细胞仪结合使用，可定位大型细胞群中的蛋白质或蛋白质活动（互作或改性）。