【Merck】蛋白质含量测定：二喹啉甲酸法（BCA法）

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Merck BCA 71285-3

蛋白质含量测定是实验室最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、考马斯亮蓝法（Bradford法）和二喹啉甲酸法（BCA法）。

二喹啉甲酸法（BCA法）

原理：

在碱性环境下蛋白质分子中的肽键结构能与Cu²⁺络合生成络合物，同时将Cu²⁺还原成Cu⁺。而BCA试剂可敏感特异地与Cu⁺结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562nm处有最高吸收峰。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。

特点：

1. 优点是灵敏度高，与Lowry法相比几乎没有干扰物质的影响，反应简单，终产物稳定。

2. 缺点是反应时间较长。

下面介绍具体实验方法：

需要的耗材及设备

• BCA蛋白定量试剂盒（货号71285-3）

• BSA标准品

• 分光光度计

• 小试管或96孔板

操作指南

一、制备BSA浓度标准曲线

按下表制备各稀释梯度的BSA标准液。每个标准液都需要使用一个新的试管。建议采用与蛋白样品一样的缓冲液来稀释、配制BSA标准液。如果缓冲液中有干扰BCA法的成分，则用去离子水替代样品的缓冲液。

表3.制备浓度梯度BSA标准液

管号	BSA的体积	稀释液的体积	BSA的终浓度
1	从2mg/ml溶液中取250μl	250ul	1000ug/ml
2	从管1中取250μl	250ul	500ug/ml
3	从管2中取250μl	250ul	250ug/ml
4	从管3中取300μl	300ul	125ug/ml
5	从管4中取100μl	400ul	25ug/ml
6	0	400ul	0ug/ml

二、BCA蛋白定量的工作液的制备

按下表制备BCA工作液。工作液是以50份的BCA反应液与1份4%硫酸铜混合而成。注意：标准型测定的BCA工作液的体积是每反应1ml；这对于小吸光杯（0.7ml）足够了，如果采用较大的吸光杯，则需要3ml以上的BCA工作液。

定量的操作步骤

以下提供了2种定量操作：标准型定量需要的蛋白样品较多（50μl），这种情况下BCA工作液与蛋白样品的体积比是20:1，干扰定量的物质的影响会较小；微型定量需要的蛋白样品量较少（25μl），非常适合96孔板式的高通量操作。此种情况下BCA工作液与蛋白样品的体积比是8:1，干扰定量的物质的影响相对会较大。

三、标准定量操作

1. 吸取50μl标样或样品到标记好的试管中。

2. 加入1ml BCA工作液，轻柔涡旋混匀。

▲tips：如果吸光杯测量时要求的溶液体积较大，反应体系体积可能需要增加到3.15ml（即3ml BCA工作液加150μl标样或样品）。

3. 标准检测：在37°C孵育30min或室温放置2–16h。加强型检测：在60°C孵育15min。

4.将试管冷却至室温。

▲tips：虽然在冷却至室温的过程中显示反应仍在继续，如果10min内进行读数蛋白浓度也不会产生误差。

5. 在一个干净的吸光杯中加入1ml水，在波长562nm调零。

6. 将待测液加入干净的吸光杯。

7. 10min内测定并记录所有反应液的吸光值（A562）。

8. 校正的吸光值是将各标样和试样的读数减去空白样吸光值。

9. 结合已知的BSA标样的量和校正过的吸光值画出标准曲线。