【Merck】蛋白质含量测定：考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定是实验室最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、考马斯亮蓝法（Bradford法）和二喹啉甲酸法（BCA法）。
考马斯亮蓝法（Bradford法）
原理：
考马斯亮蓝法（Bradford法）是1976年由Bradford建立的一种蛋白质测定法。该方法中利用考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕红色变为蓝色。该染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（尤其是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比。
特点：
1.优点是快速（反应时间仅需2min）且灵敏度高，几乎没有蛋白损失。
2.缺点是用于不同蛋白质测定时有较大偏差，并且去垢剂等物质可对测定结果造成干扰。
下面介绍具体实验方法：
需要的耗材及设备
• Bradford试剂（考马斯亮蓝G磷酸甲醇溶液，货号B6916）
• BSA蛋白标准溶液（2mg/ml，货号P0834，或者1mg/ml，货号P0914）
• 分光光度计（可测量吸收值为595nm区段）
• 试管，13×100mm（货号CLS980013）
• 96孔板（货号CLS9017）及96孔板封板膜（货号Z369667）
• 3ml抛弃型塑料比色皿（货号C5291）
• 1ml抛弃型塑料比色皿（货号C5416）
操作指南
一、标准3.1mL体系定量操作
（适用于检测体积约0.1mL，浓度范围在0.1–1.4mg/ml蛋白样品）
在试管中进行这个检测。每管样品由0.1ml蛋白样品和3ml Bradford试剂混合而成。也可以直接在比色皿中向0.05ml样品中加入1.5ml Bradford试剂。
1. 温和混匀瓶中的Bradford试剂，并放置至室温。
2. 用与待测样品同样的缓冲液配制所需浓度的蛋白标准品。以2mg/ml或1mg/ml BSA蛋白标准品为起点进行倍比稀释（表1）。去离子水也可替代缓冲液，但蛋白样品缓冲液中任何干扰成分的影响不会被相应体现。蛋白标准品浓度范围为0.1–1.4mg/ml。做一个类似表1的标样测定表。
表1
管号 | 样品（ml） | BSA蛋白标准品（mg/ml） | Bradford试剂（ml） |
1 | 0.1 | 0 | 3 |
2 | 0.1 | 0.25 | 3 |
3 | 0.1 | 0.5 | 3 |
4 | 0.1 | 1 | 3 |
5 | 0.1 | 1.4 | 3 |
6 | 0.1 | 未知 | 3 |
采用1mg/ml标准品（货号P0914）或2mg/ml标准品（货号P0834）配制蛋白标准品。每管里有0.1ml已知浓度的标准品，空白对照（仅有缓冲液）或未知样品。
3. 在每个试管中加入3ml Bradford试剂后，温和充分涡旋混匀。每个试管中液体总体积为3.1ml。
4. 样品在室温下孵育5–45min。
5. 将样品转入比色皿。
6. 测量595nm吸收值。蛋白-染料复合物可以稳定达60min。所有样品都应在60min内记录吸光值，互相之间不超过10min。
7. 比对蛋白样品和标样的吸光值，参照标准曲线，得出未知样品的蛋白浓度（表2和图1）。
表2：分析数据样例
用测试得到的吸光值做一个表格
管号 | A595 | A595换算值 | 蛋白（mg/ml） | 稀释倍数 |
1 | 0.433 | 0 | 0 | 1 |
2 | 0.742 | 0.308 | 0.25 | 1 |
3 | 1.036 | 0.602 | 0.5 | 1 |
4 | 1.463 | 1.029 | 1 | 1 |
5 | 1.75 | 1.316 | 1.4 | 1 |
6 | 1.245 | 0.811 | 0.75 | 2 |
得到结果后，绘制标准曲线以确定未知样品中的蛋白浓度。比照595nm的Net Absorbance和蛋白标准品浓度（管1-5）。
图1 标准曲线
标准曲线提示未知蛋白样品试管6（Net A595 = 0.811)含有的蛋白浓度为0.75mg/ml。
原有未知蛋白总浓度计算：(mg/ml未知蛋白样品)乘以（稀释倍数），即(0.75mg/ml)×(2) = 1.5mg/ml
二、2mL小型定量操作
(适用于检测体积约1ml，浓度范围在1–10μg/ml蛋白样品)小型检测用于体积较大（至少1ml）的稀释样品。这个检测的线性浓度范围比标准或多孔板检测都低（1–10μg总蛋白/ml）。
1. 温和混匀瓶中的Bradford试剂，并放置至室温。
2. 用BSA或类同的蛋白标准品配制浓度1–10μg/ml范围的系列标准品。
3. 每个试管加入1ml蛋白标准品。在作为空白对照的管中加入1ml缓冲液。
4. 将待测样品配制成浓度处于1–10μg/ml，每管试管加入1ml样品。
5. 每管试管加入1ml Bradford试剂并混匀。
6. 样品在室温下孵育5–45min。
7. 将样品转入比色皿。
8. 测量595nm吸收值。蛋白-染料复合物可以稳定达60min。所有样品都应在60min内记录吸光值，互相之间不超过10min。
9. 比对蛋白样品和标样的吸光值，参照标准曲线，得出未知样品的蛋白浓度。
三、96孔板式定量操作
(适用于检测体积约5μl，浓度范围在0.1–1.4mg/ml蛋白样品)
这个检测在96孔板中进行。可以对小体积（5μl）众多样品进行快速检测。多孔板格式甚至可以进行自动化检测。
1. 温和混匀瓶中的Bradford试剂，并放置至室温。
2. 用BSA或类同的蛋白标准品配制浓度0.1–1.4mg/ml范围的系列标准品。
3. 在96孔板的不同孔中加入5μl蛋白标准品。空白对照孔中加入5μl缓冲液。
4. 将未知待测样品配制成浓度0.1–1.4 mg/ml。
5. 在加过样的孔中加入250μl Bradford试剂，摇晃混匀30s。
6. 样品在室温下孵育5–45min。测量595nm吸收值。蛋白-染料复合物可以稳定达60min。所有样品都应在60min内记录吸光值，互相之间不超过10min。
7. 比对蛋白样品和标样的吸光值，参照标准曲线，得出未知样品的蛋白浓度。
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