【Merck】FLAG标签融合蛋白的亲和纯化：磁珠法

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Merck M8823 C2978 B7435 B7310 C8740 P8340 M1542 M1167 M1292 LSKMAGS08 LSKMAGS15 M1167 SHM05 CELLMM2 FLAGIPT1 TP0010 A2220 M8823 F2426 F4799 F3290 A4596 F7425 P2983

FLAG标签（即DYKDDDDK）是一种经精心设计的、仅有8个氨基酸的人工序列，用于蛋白纯化和检测。已广泛用于各种细胞类型。这个小肽分子量仅为1.01kDa，却有着别的标签不具备的显著优势：

• 对目的蛋白没有干扰-不会占据表位与结合域，避免导致融合蛋白的功能、分泌性以及转运发生改变

• 纯度高-M2抗体特异性极佳，通常FLAG纯化得到的蛋白纯度足够高而不需要进一步纯化

• 亲水性好-定位在融合蛋白表面，非变性亲和层析获得有活性的高纯度蛋白

• 灵敏度高-不论标签N-/C-端或内部，均可被抗FLAG的抗体识别，灵敏度是其它标签的20–200倍，达到<10fmol

• 去除方便-融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK）而得到天然目的蛋白

• 应用广泛-用于细菌、酵母和哺乳细胞系统，可以用IP-coIP/IHC/ICC/IF/WB/ELISA/流式细胞等检测、鉴定

根据与FLAG抗体偶联的树脂材质的不同，可以分为琼脂糖法和磁珠法，下面介绍磁珠法的操作方法。

需要的试剂及设备

磁珠法

• ANTI-FLAG® M2磁珠(货号M8823)

• 表达FLAG融合蛋白的细胞样品

• 裂解液：哺乳动物细胞裂解液CelLytic M（货号C2978）或大肠杆菌裂解液CelLytic B（货号B7435 / B7310 /C8740），或自行配制裂解液（50mM Tris HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1% TRITON X-100）

• 蛋白酶抑制剂混合物(货号P8340)用于哺乳动物细胞和组织样品

• 离心管（货号M1542，M1167）

• 组织培养瓶（货号M1292）

• 磁力架（货号LSKMAGS08，LSKMAGS15，M1167，SHM05）

• 不要使用磁力搅拌装置，这样会损坏磁珠

操作指南

小规模亲和纯化实验有多种操作方法。以下描述是针对单一样品的操作。

如果是批次纯化，推荐每个反应取用100µl 树脂珠悬浊液（即50µl柱床）。如果是96孔板形式，10µl柱床/孔。磁珠的使用量可根据样品中的目标蛋白量和磁力架的情况来调整。

第一部分：样品的准备

1.将蛋白抽提物的pH调至pH7–8。加入至少0.15M的盐（如NaCl或KCl）有助于减少杂蛋白非特异性结合到树脂上。

2.FLAG融合蛋白抽提物预先要去除所有不溶物。多数不溶物可通过10,000–20,000g离心15min去除。蛋白抽提物经过0.45或0.22µm孔径过滤器过滤可进一步去除所有会干扰结合的细胞及颗粒。

第二部分：亲和纯化

FLAG融合蛋白可采用批次或96孔板式纯化。较大体积的裂解物，推荐采用批次纯化方式，可以在大体积抽提物中快速结合目的蛋白。如果样品较小，则可以采取免疫沉淀方式进行纯化。

ANTI-FLAG M2磁珠是含50%甘油和缓冲液的悬浮液。只有在使用前才去掉甘油，并用缓冲液平衡树脂（步骤1-5）。

平衡可以在常温或2–8°C下操作。每次只取用纯化操作需要用量的树脂（表2）。树脂在TBS缓冲液（50mM Tris HCl，150mM NaCl，pH7.4）中放置不要超过24hr，除非其中加入抗菌剂（如0.02%叠氮化钠）。

表1 磁珠的载量

▲tips：抗原和蛋白-蛋白复合物采用的裂解液其中的表面活性剂含量不同，建议要对树脂进行预测试。

ANTI-FLAG M2亲和胶可以耐受很多种表面活性剂，如5.0% TWEEN20，5.0% TRITON X-100，0.1% IGEPAL CA-630，0.1% CHAPS及0.2%洋地黄皂苷。也可以与1.0M NaCl或1.0M尿素兼容。请参考后附的化学兼容性列表（表2）。

1. 温和颠倒将树脂充分混匀。确保瓶中的ANTI-FLAG M2亲和胶悬浊液非常均匀。取出纯化需要的用量（表2）。

2. 立刻将悬浊液加到合适的试管里。用5倍柱床体积的TBS漂洗磁珠。充分混匀。将试管放到磁力架上收集磁珠。移除并弃去储存缓冲液和TBS。

3. 再用5倍柱床体积的TBS重悬平衡磁珠，充分混匀。

4. 将试管放到磁力架上收集磁珠。移除并弃去TBS。

5. 再次重复步骤3和4。磁珠上可留下少量缓冲液。

6. 将蛋白样品（参考样品的准备部分）与平衡过的磁珠（步骤5）孵育约1hr以捕获FLAG融合蛋白，其间采用搅拌装置或摇板温和混合。不要用磁力搅拌器以免破坏磁珠。这个步骤可以在2–8°C或室温下进行。孵育时间短则30min，也可长达数小时。如果孵育超过3hr，要加入蛋白酶抑制剂和抗菌剂以防止微生物滋生和蛋白水解。

7. 一旦结合步骤完成，将试管放到磁力架上收集磁珠并弃去上清。

8. 用20倍柱床体积的TBS漂洗树脂3次去除非特异性结合蛋白。

9. FLAG蛋白可用低pH或FLAG多肽竞争从树脂上洗脱。

a.用酸性条件甘氨酸洗脱FLAG融合蛋白–用6×1ml0.1M glycine HCl, pH3.5（含15–25µL 1M Tris, pH8.0）洗脱FLAG融合蛋白。不要将柱子留在glycine HCl中超过20min。洗脱后尽快再平衡至中性pH。

b. 或者采用FLAG多肽竞争性洗脱FLAG融合蛋白：用5个1倍柱体积TBS缓冲的含100µg/ml FLAG多肽（货号F3290）竞争性洗脱FLAG融合蛋白。

10.清洗磁珠-使用过后尽快用3倍柱床体积的0 . 1 M glycine HCl, pH3.0漂洗。其后柱子要立即用TBS再平衡，直到pH为中性。

11.磁珠的保存- 清洗后将试管置于磁力架收集磁珠，弃去缓冲液。磁珠以50%悬浊液形式存放于含50%甘油和0.02%叠氮化钠的TBS或PBS缓冲液中。存放于2–8°C或–20°C，注意不要漏液干掉。

▲tips：可在280nm读数以确定杂蛋白是否洗干净。持续清洗直至洗出液与空白洗液的吸光值差异小于0.05。

表2 试剂兼容性列表

默克生命科学提供完备的FLAG系列产品：

• Sigma拥有FLAG^®和ANTI-FLAG^®注册商标，纯化树脂/磁珠/抗体的质量被业界高度推崇

• 产品线配套齐全，全方位满足FLAG相关表达、纯化、检测等需求

• FLAG M2抗体性能尤为优越，不依赖Ca²⁺离子，可以识别所有形式的FLAG序列，包括N端Met-FLAG，形成的纯化琼脂糖/磁珠和检测抗体成为行业标杆产品

• 高分引用文献众多

类型	产品描述	包装	目录号
纯化试剂盒	FLAG® M Purification Kit	3~5次	CELLMM2
IP 试剂盒	FLAG® Immunoprecipitation Kit	50次	FLAGIPT1
串联亲和纯化	FLAG® HA Tandem Affinity Purification Kit	5次	TP0010
纯化 /IP	ANTI-FLAG® M2 Affinity Gel	1mL,5mL, 10mL25mL，2x25mL4x25mL	A2220
	ANTI-FLAG® M2 Magnetic Beads	1mL, 5mL	M8823
	EZview™ Red ANTIFLAG® M2 Affinity Gel	1mL, 5x1ml	F2426
	3X FLAG® Peptide	4mg, 25mg	F4799
	FLAG® Peptide	4mg, 25mg	F3290
	ANTI-FLAG® M1 Agarose Affinity Gel	1mL,5mL, 10mL25mL	A4596
IP、ICC、WB	ANTI-FLAG® antibody produced in rabbit	2mg	F7425
高通量纯化、检测	ANTI-FLAG® High Sensitivity, M2 coated 96-well plates	1块	P2983