【Merck】使用抗体对包埋类器官进行免疫荧光染色
原理简介
类有机化合物具有复杂的三维结构，并且嵌入ECM水凝胶，使表征变得困难。使用抗体对类器官进行免疫荧光(IF)染色，可以观察细胞行为、增殖、分化、细胞健康和识别的分子标记物。包埋免疫染色适用于小块组织，无需切片，方法与冷冻切片的免疫细胞化学(ICC)或免疫组化(IHC)染色非常相似。类器官包埋染色可用于基于抗体的鉴定。在该类器官染色方案中，我们详细介绍了通过免疫荧光共聚焦显微镜分析固定、渗透和染色包埋类器官的方法。
图1. 使用抗体的类器官免疫荧光检测。使用乙酰-α-微管蛋白(A)、α-碳酸酐酶IV (B)和Sox-9 (AB5535) (C)抗体染色的人肠上皮细胞和肺类器官。
操作指南
使用抗体对包埋类器官进行免疫荧光染色
一、试剂耗材准备
验证过可以用于类器官的试剂
产品编号 | 说明 |
SCM300 说明 | 3dGRO™ Organoid Dissociation Reagent Chemically defined enzyme-free organoid dissociation solution. |
SCM301 | 3dGRO™ Organoid Freeze Medium Optimized cryopreservation media for multiple organoids cell types. |
SCM162 | DMEM/F-12 Medium Advanced DMEMF12 basal media used in low-serum or serum-free media formulations including stem cell and 3D organoid cell cultures. |
验证过可以用于类器官的抗体
产品编号 | 说明 |
AB5535 | 抗Sox9抗体 Chemicon®, from rabbit |
MAB3400 | Anti-Vimentin Antibody, clone V9 clone V9, Chemicon®, from mouse |
二、实验步骤
1. 从类器官培养液中取出培养基，用1XPBS (D8537)轻轻清洗2遍。
2. 用15-20 mL 4% PFA (1.00496)在10厘米的培养皿中固定30-40个类器官ECM凝胶圆顶结构，室温下放置30-60分钟。
注意：在PFA中固定时，ECM凝胶会部分溶解。
3. 时时旋转培养皿，分离ECM凝胶圆顶结构，从ECM凝胶释放类器官。
注意：并非所有类器官都会从ECM凝胶中释放。
4. 将15-20mL的固定液从10厘米的培养皿中倒入到50mL锥形管中，让类器官凭借重力沉降在管底部（~10-15分钟）。
5. 当类器官凭重力沉降在50 mL锥形管底部后，小心地抽吸固定液，尽量避免在过程中抽吸类器官颗粒。
6. 在第4步的培养皿中加入15-20 mL 1X PBS (D8537)，在室温下静置15-20分钟。
7. 15-20分钟后，旋转培养皿以进一步分离ECM凝胶圆顶结构，并将1X PBS (D8537)倒入第5步中含有类器官颗粒的50毫升锥形管中。
8. 将步骤5-7再重复三次。
9. 在不伤害类器官颗粒的情况下吸出溶液，通过在50 mL锥形管含有类器官颗粒的一侧分液，加入5 mL 1X PBS (D8537)，并旋转试管使类器官颗粒重悬。
注意：不要用吸管上下移动。否则会破坏大部分类器官。
10.将5 mL含有类器官团块的1X PBS (D8537)直接倒入含有未分离类器官ECM凝胶圆顶结构的10厘米培养皿中。
11.将另一份5 mL 1X PBS (D8537)加入到50 mL锥形管中，采集尽可能多的类器官块，并直接将其倒入含类器官的10厘米培养皿中。
12.如果不立即使用，用保鲜膜封住 10厘米培养皿，并在4℃冰箱中保存最多1个月。
13.准备好进行免疫荧光染色时，从冰箱取出含固定类器官的10厘米培养皿，并在解剖显微镜下观察。
14.剪去1mL移液管尖端，使管身足以吸收类器官，而不会剪断或破坏。
15.将类器官(1-4)转移到8孔腔载玻片中，用P-200移液管去除残留的1XPBS (D8537)。避免吸入类器官，通过未切割的P-200针尖剪断。
16. 用0.5mL阻断缓冲液（5%马血清+0.5% Triton X-100，溶于1XPBS中）在4℃留置一夜或室温下留置2-4小时，渗透固定类器官。
注：推荐使用与二次抗体宿主同种的血清。
17. 用P-200移液管从含类器官的载玻片上移除阻断缓冲液。避免通过P-200针尖移液。
18.在阻断缓冲液中制备初级抗体(300-500 µL)或直接偶联抗体(300-500 µL)。
19.将稀释后的抗体加入含类器官的适当标记的孔中。
20.在4°C下孵育一夜。
21. 第二天，用1XPBS(D8537)清洗3次，每次10-15分钟。
注：如果使用直接偶联抗体，样品便可在共聚焦显微镜上成像。
22.如果使用未偶联的初级抗体，在阻断缓冲液中制备二次抗体(300-500 µL)，并将二次抗体添加到适当标记的样品中。
23.在4℃下用二次抗体染色一夜。
24.第二天，用1XPBS(D8537)清洗3次，每次10-15分钟。
25. 用P-200移液管从每个含类器官的孔中移除阻断缓冲液。避免通过P-200针尖移液。
26.通过添加的5 µg/mL DAPI (D9542) 在1X PBS（每份样品300-500 µL）中准备核染色。
27. 为每个样品添加DAPI染色液，在室温下孵育15-20分钟。
28.用1X PBS (D8537)清洗3次，每次10-15分钟。
29.样品已准备就绪在共聚焦显微镜上成像。
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