【Merck】类器官传代方案
原理简介
类器官是源自原代组织或干细胞的一种体外衍生的3D细胞聚集体，能够自我更新、自我组织并表现出器官功能。类器官可提供以下功能以解决现有2D模型系统的局限性：
• 与原代组织相似的组成和结构：类器官含有少量自我更新的干细胞（如肠隐窝干细胞），这些干细胞可以分化成所有主要细胞谱系的细胞，其分化频率与生理条件下相似。
• 模拟体内条件的相关模型：类器官比其他任何模型系统都更具有生物学相关性，并且可以操纵壁龛成分和基因序列。
• 可进行扩展培养的稳定系统：利用干细胞的自我更新、分化能力和内在的自组织能力，类器官可以作为生物库冷冻保存并无限扩增。
3dGRO™ 类器官解离试剂是一种专有的化学成分明确的无酶解离溶液，可用于传代多种类器官细胞类型。由于化学成分明确，该试剂能够产生一致的类器官传代结果。
3dGRO™ 类器官解离试剂可与3dGRO™ R-Spondin-1 条件培养基补充剂 (SCM104) 结合使用，从小鼠体内分离并传代原代肠道类器官，或与 3dGRO™ 人 iPSC 衍生结肠类器官扩增培养基(SCM304)结合使用，以扩增人iPSC衍生的结肠类器官(SCC300)。
操作指南
类器官传代方案
一、试剂耗材准备
3dGRO™ 类器官解离试剂（货号：SCM300）
DMEM/F12培养基（货号：D6421, D8437）
二、实验步骤
以下实验方案可用作一般操作指南。不同的类器官系统可能需要对孵育时间进行优化。
1. 计算圆滴中存在的类器官的数量。根据计数的类器官数量，每个新圆滴将包含至少50-100个类器官。因此，例如，如果计算的类器官总数为100，则可以计划将这些类器官分别传代至2个新圆滴中。
2. 吸出培养基。在含有类器官圆滴的24孔板的每孔中加入1 mL 3dGRO™ 类器官解离试剂。使用p1000移液器，上下吹打10次，将类器官圆滴分离成更小的碎片。将分离的类器官混合物转移至50 mL锥形管中。
3. 用0.5 mL 3dGRO™ 类器官解离试剂冲洗每个孔。将上清液与锥形管内混合物混合。
4. 在室温下轻轻旋转锥形管10分钟。添加20-30mL DMEM/F12或DMEM以稀释3dGRO™类器官解离试剂。4°C下500-650xg离心5分钟。
5. 小心吸出上清液，留下约100 μL培养基。
注意：不要触碰吸入底部沉淀，否则可能会无意中吸入较小的类器官。
6. 加入10 mL DMEM/F12或DMEM，并在4°C下700xg离心5分钟。
7. 小心吸出上清液，留下约50-100 μL培养基。使用20 μL移液管吸头，小心取出剩余的上清液。
8. 根据步骤1中计数的类器官数量，用适量冰冷的减量生长因子ECM凝胶(50 μL/圆滴) 重悬类器官沉淀。
注意：每个新圆滴应包含至少50-100个类器官。
9. 轻轻上下吹打10-20次。避免产生气泡。快速将类器官混合物的50 μL等分到新24孔板中的孔中心。避免产生气泡。
10.将孔板在37°C下孵育10分钟。在每孔中轻轻加入750 μL的类器官培养基；避免直接添加到圆滴上。每次传代后的前2-3天应将10μM ROCK抑制剂添加到培养基中以增强细胞活力。
11.每隔一天更换一次培养基。
12. 小鼠类器官每7天传代一次，人肠道和结肠类器官每10-12天传代一次。起始阶段，向每个圆滴中接种50-100个类器官。可以根据类器官系统在后续传代中调整传代稀释比例。
图1. 3dGRO™ 类器官解离试剂可以实现以高细胞活力有效地对原代小鼠肠道类器官进行传代。图像代表在优化的类器官扩增培养基中传代后第10天状态。
图2.3dGRO™ 类器官解离试剂可以实现以高细胞活力有效地对人iPS分化结肠类器官进行传代。图像代表在优化的类器官扩增培养基中传代后第10天状态
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