【Merck】酶联免疫吸附实验(ELISA)常见问题及解决方案

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ELISA Merck

酶联免疫吸附实验 (ELISA) 是结合了抗体的特异性和简单酶分析法的高灵敏度蛋白检测方法。通过采用抗体-抗原反应，ELISA可以提供抗原或抗体浓度测量。有两种常用的ELISA形式:：双抗夹心ELISA和竞争性ELISA。图解和描述如下图。

实验中最常用的是双抗夹心ELISA，它用于测定未知样品中的抗原浓度，是最有用的免疫分析法之一。夹心ELISA快速且准确，并且如果提供纯化的抗原标准品，该分析法可用于生成剂量-反应曲线，用于测定未知样品中抗原的绝对量。

使用该分析法时的“夹心”产生过程:

●将一种纯化的、靶标特异性抗体 (“捕获”抗体) 结合在固定相上-通常附着在平板孔的底部。

●加入样品 (可能含有未知量的抗原) ，使其与捕获抗体发生结合反应。通过洗涤除去未结合的样品

●加入一种标记抗体 (“检测”抗体) ，使其与抗原结合。

在双抗夹心ELISA中，捕获抗体和检测抗体的选择一分重要，直接关系到实验结果的准确性、特异性和灵敏度

夹心法ELISA和竞争性ELISA之间的差别

Troubleshooting

问题2：信号弱
可能原因	解决方案
所用实验试剂稀释度错误	检查所用的实验稀释度（按照说明书推荐的稀释度进行实验）
仪器的过滤器选择错误（波长）	检查微孔板分光光度计中的波长。
孵育时间过短，温度过低	检查在产品说明书中该批次的孵育时间。（酶底物的孵育时间用于20-28℃范围内）；如果吸光度低于1.0，则延长底物的孵育时间
试剂温度不正确	使用之前应确保所用的试剂已回复至室温（20-28℃）。
在较高浓度时，叠氮化钠、巯基乙醇或DTT可能干扰过氧化物酶活性.	使用不含或含有较低浓度（<0.1%）叠氮化钠、巯基乙醇或DTT的样品。

问题3：信号高
可能原因	解决方案
所用实验试剂稀释度错误	检查所用的实验稀释度（按照说明书推荐的稀释度进行实验）。
孵育时间过长，温度过高	检查在产品说明书中该批次的孵育时间。（酶底物的孵育时间用于20-28℃范围内）；如果吸光系数高于3.0，则缩短底物的孵育时间。

问题4:本底较高
可能原因	解决方案
洗涤不足	增加洗涤次数，每次洗涤后将液体除净。
洗涤污染	确认水没有被污染。始终使用重蒸水配制和稀释洗涤液。
试剂或小瓶/试管受到以前实验的污染	如果实验试剂将用于进一步测量，应避免直接使用移液管从试剂瓶中移取。（氧化活性污染物可通过非特异性显色影响酶底物）。
所用实验试剂（抗体和酶结合物）稀释度错误	检查所用抗体和酶结合物的实验验稀释度。

问题5:准确度较低（=偶然误差）
可能原因	解决方案
不均匀样品，如混浊液、样品中有颗粒物	检查确保样品根据建议的样品操作抽提、配制和贮藏（聚丙烯试管，澄清样品的贮藏温度为-20℃）。
样品和标准品混匀不充分	配置样品和标准品时充分混匀
移液器加样不准	检查您的移液器，必要时进行校准。
移液器在样品和 /或标准品使用时存在遗留	在每次移液器移取后更换移液器吸头。
在孵育过程中试剂混合不充分	加样后，充分震荡微孔板，使试剂混匀
洗涤不充分	检查自动微孔板洗板机能正常工作；在每个洗涤步骤后，必须完全除去残留液体。
液体蒸发	在孵育过程中，检查密封盖与平板的接触情况。

问题6:计算的数据过高或过低（=系统误差，数据与“标准数据”的偏差）
可能原因	解决方案
稀释倍数的计算不正确	确保样品所用的稀释倍数在数据计算范围内。
修改实验程序	认真遵守产品说明书中的指示（孵育时间、稀释等）。
样品处理不正确	确保样品根据建议的样品操作抽提、配制和贮藏（聚丙烯试管，澄清样品的贮藏温度为-20℃）。