【Corning】354250 Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel细胞封装过程

Corning® PuraMatrix™ Peptide Hydrogel (CorningPuraMatrix) 是一种用于创建定义的三维微环境的合成基质，可用于各种细胞培养实验。为了实现最佳的细胞生长和分化，需要确定该材料和生物活性分子（例如生长因子、细胞外基质（ECM）蛋白和/或其他分子）的适当混合比例。CorningPuraMatrix由标准氨基酸（1% w/v）和99%水组成。在生理条件下，CorningPuraMatrix的肽组分自组装成为具有 nm级纤维结构的3D水凝胶，平均孔径为50-200 nm。该水凝胶可以方便地在培养皿、多孔板或细胞培养插入物中形成。

CorningPuraMatrix除了可以提供3D细胞培养，还能够进行更简单的2D培养。许多细胞类型在CorningPuraMatrix表面培养时形成适当的3D形态，与细胞夹心培养系统相比，简化了开发3D体外模型系统所需的工作。研究表明，与2D培养的细胞相比，形成3D结构的细胞更接近其体内对应物。CorningPuraMatrix允许定义的微环境更好地再现体内环境，从而提高在高通量环境中进行的实验所得结果的预测质量。

研究表明，CorningPuraMatrix支持肝祖细胞、大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12）和海马神经元的分化，同时促进内皮细胞的管状生成。研究还表明，CorningPuraMatrix支持各种原代细胞（例如神经元、成纤维细胞和角质形成细胞）和转化细胞（例如MG-63、SH-SY5Y、HEK293和NIH3T3）的附着。其他潜在的应用包括干细胞增殖和分化、肿瘤细胞迁移以及组织再生的体内分析。CorningPuraMatrix具有生物相容性、可吸收性，并且不含动物来源的材料和病原体。对于动物体内研究，可将可溶性材料注射到体内，随后在与生理环境接触时形成3D水凝胶。

表   PuraMatrix™ Peptide Hydrogel 354250产品信息

① 每次使用Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel原液（1% w/v）时，通过涡旋或在浴式超声波中超声30分钟来降低其黏度。如果有气泡存在，在1.5毫升微管中将原液进行离心。

② 使用无菌20%蔗糖稀释原液，制备所需浓度的适量Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel溶液，在10%蔗糖中得到2倍浓度的Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel。有关细胞培养板体积建议，请参见表格。

③ 用胰蛋白酶处理细胞，并离心得到所需数量的细胞（大多数细胞类型的最终密度通常为5×105-1×10⁶ cells/ml）。

④ 从细胞沉淀中去除培养基，并在无菌10%蔗糖中将细胞重悬至所需密度。

⑤ 再次离心收集细胞，并在10%蔗糖中以2倍最终所需细胞密度重悬细胞。

⑥ 将2倍浓度的Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel和2倍浓度的细胞/蔗糖混合物等体积混合，然后小心地加入培养皿中央，不要引入气泡。

⑦ 通过轻轻将培养基沿着培养皿侧面流到水凝胶上方，开始Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel的凝胶化。

⑧ 重复操作，直到所有孔中都放入了细胞。

⑨ 在接下来的一个小时内非常轻柔地更换培养基两次，以进一步平衡水凝胶的pH。不要使用抽真空吸引器，并只去除约2/3到3/4的培养基，以避免破坏Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel。

⑩ 根据需要使用步骤9中描述的程序进行细胞培养。

以下方案基于使用Falcon® 24孔细胞培养插件目录号：353095）和Falcon细胞培养插件配套板（目录号：353504）。

对于浓度为0.25％的Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel的情况，建议使用细胞培养插件以便于培养基的更换，并确保水凝胶不被破坏。建议将浓度低于0.25％的Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel用于神经元和内皮细胞的封装。对于其他细胞类型，建议测试一系列水凝胶浓度以进行封装。

Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel制备

① 每次使用Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel原液（1％w/v），通过涡旋混合或在浴式超声波中超声处理30分钟，降低其黏度。如果有气泡存在，将原液的一部分在无菌EP管中高速离心。

② 在无菌EP管中使用无菌的20％蔗糖将Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel原液稀释至适当体积的所需浓度，生成10％蔗糖中的2倍浓度的Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel。建议每个24孔细胞培养插件使用的总体积为100微升（即10％蔗糖中的2倍浓度的50微升Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel和10％蔗糖中的2倍浓度的50微升细胞）。请参考第16页的表格获得细胞培养插入物体积建议。例如，为了在最终浓度为0.15％的Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel中封装神经元和内皮细胞，需要准备10％蔗糖中的0.30％Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel的原液（对于1毫升，将500微升的20％蔗糖，300微升的Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel和200微升的无菌H2O混合）。

③ 轻轻振荡混合。

④ 建议为每个细胞培养插件或孔单独设置一个孔用于混合细胞和Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel。所需量的Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel可以一次分配给所有的管。

细胞接种

由于Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel的pH较低，工作时需要迅速行动，以在加入培养基之前最大限度地减少细胞与材料接触的时间。当接种多个孔时，建议每个EP管单独准备，而不是一组准备，以避免细胞在没有培养基的情况下长时间接触Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel。

① 用胰蛋白酶处理细胞，并离心下来所需数量的细胞（对于大多数细胞类型，最终浓度通常为5×105-1×106个细胞/毫升）。

② 将所需数量的细胞培养插件放入插入物配套板中。通过沿着插件和孔之间的外侧孔向每个插件的下腔中加入250微升培养基。小心使用移液管，以避免在插件下产生气泡。培养基应该只触及插件的底部。

③ 从细胞沉淀中去除培养基，并在无菌的10％蔗糖中将细胞重新悬浮至所需密度。

④ 再次离心收集细胞，并用10％蔗糖重新悬浮，使细胞的浓度为最终所需细胞浓度的2倍。

⑤ 快速将稀释的10％蔗糖中的2倍浓度的Corning PuraMatrix Peptide Hydrogel与相等体积的10％蔗糖中的2倍浓度的细胞悬浮液在EP管中混合，使用轻柔的移液操作。细胞加入后不要涡旋或翻转。

⑥ 快速将Corning PuraMatrixPeptide Hydrogel/细胞混合物移液至一个24孔插件中。当注入插件中心时，材料将均匀地覆盖在表面上。

⑦ 等待五分钟，使Corning PuraMatrixPeptide Hydrogel在孔中沉淀。在此期间，按照上一步描述的方法继续设置下一个插件。

⑧ 返回到第一个插件，并使用移液枪头端非常小心地在凝胶上层叠加400微升培养基（使用P200移液器，沿插入物内壁缓慢注入200微升，两次操作，以获得较小的液滴大小）。

⑨ 当所有插入物都被填满后，将板放入培养箱中，进行30-60分钟的Corning PuraMatrixPeptide Hydrogel凝胶化。对于较高浓度的水凝胶，30分钟足够；对于0.15-0.25％的水凝胶，最好进行一小时的平衡。在此期间，插件和孔之间的培养基液面水平可能会达到一定的平衡。

⑩ 在不干扰水凝胶的情况下更换培养基。由于凝胶化的Corning PuraMatrixPeptide Hydrogel很难看到，最好的方法是使用P200移液器移除凝胶上方约2/3的培养基，并保持移液枪头端在插件底部上方。不要使用真空吸取器从凝胶上方吸取培养基，因为这会干扰Corning PuraMatrixPeptide Hydrogel支架和细胞。

⑪ 孔底下的培养基可以使用真空吸取器或移液枪头端移除。

⑫ 非常轻柔地重新添加培养基到插件和孔中。将板放入培养箱中30分钟，然后再次进行培养基更换，并再次孵育。这将平衡Corning PuraMatrixPeptide Hydrogel的pH值并去除多余的蔗糖。在第二次更换后，将200-350微升培养基放入插件中，将700-900微升放入孔中。

⑬ 为了进一步给细胞提供养分，大约每两天非常轻柔地更换培养基，如上所述。

①通过涡旋混合或在浴式超声波清洗器中超声处理，降低Corning® PuraMatrix Peptide Hydrogel储备液（1%重量/体积）的粘度。用无菌蒸馏水将适量的CorningPuraMatrix Peptide Hydrogel储备液稀释到无菌离心管中。对于大多数细胞类型，建议每个细胞培养插件使用总体积为100 µl，终浓度为0.25%的CorningPuraMatrix Peptide Hydrogel稀释液。通过轻轻振荡吸管混合。

②在插件伴侣板中放置所需数量的细胞培养插件。通过在插件和孔之间的外孔侧面滴液，向每个24孔插件的下腔中加入250 µl培养基。小心滴液以避免在插入物下产生气泡。培养基应触及插入物底部。有关细胞培养插件的体积推荐，请参见以下表格。

③向每个插入物的中心滴加100 µl稀释后的CorningPuraMatrix Peptide Hydrogel。等待至少30分钟，使CorningPuraMatrix凝胶化。

④非常小心地使用吸枪头端将400 µl培养基层叠在凝胶上（使用P200移液器，将200 µl（两次）加入以获得较小的液滴大小），缓慢地将其滴入插件内壁。

⑤当所有插入物都填满后，将培养皿放入细胞培养箱中，孵育30-60分钟，以完成CorningPuraMatrix Peptide Hydrogel的凝胶形成。对于较高浓度的水凝胶，30分钟足够；对于0.15-0.25%的水凝胶，最好进行一小时的平衡。在此期间，培养基的水平可能在插件和孔之间达到一定程度的平衡。

⑥在不干扰水凝胶的情况下更换培养基。由于凝胶化的CorningPuraMatrix Peptide Hydrogel很难观察到，最好的方法是使用P200移液器从水凝胶上方移除大约2/3的培养基，并将吸头保持在插件底部上方。不要使用真空吸引从水凝胶上方吸取培养基，因为这会干扰CorningPuraMatrix Peptide Hydrogel支架和细胞。可以使用真空吸引器或移液器尖端将插件下方的培养基移除。

⑦非常轻柔地将从插件和孔中移除的培养基放回，并按照上述方法更换。将培养皿放入细胞培养箱中30分钟，然后再次按照步骤⑥中的方法更换培养基，并再次孵育。这将使CorningPuraMatrix Peptide Hydrogel的pH平衡，并去除多余的蔗糖。在第二次更换后，向插件中加入200-350 µl的培养基，向孔中加入700-900 µl的培养基。

⑧为了进一步提供细胞营养，按照上述方法，每隔大约两天非常轻柔地更换培养基一次。

注意：这是使用Falcon细胞培养插件和伴侣板进行表面播种附着细胞的特定步骤。