【Corning】354240: Cell-Tak™ 细胞和组织粘附剂产品使用说明

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Corning 细胞外基质 ECM 生物涂层 Biological Coatings Matrigel Matrix Cell-Tak 细胞和组织粘附剂产品胶原蛋白 Collagen 层粘连蛋白 Laminin PuraMatrix BioCoat Poly-D-Lysine Fibronectin Synthemax vitronectin substrate

Corning® Cell-Tak™ Cell and Tissue Adhesive（354240）是一种特殊配方的蛋白质溶液，设计用于涂覆基质以固定细胞或组织。它可以简化生物样品在许多体外常见技术中的操作，包括：

● 建立初级培养物

● 原位杂交

●免疫测定

●微注射

●免疫组织化学

Cell-Tak™ Cell and Tissue Adhesive是从海蚌Mytilus edulis中提取的“多酚蛋白质”。这类相关蛋白质家族是海蚌在自然环境中用于将自身锚定在固体上而分泌的关键成分。这些蛋白质由相似氨基酸序列的十肽单元串联重复组成。

包被方法

主要有两种使用Cell-Tak adhesive涂层包被方式：手工涂布和吸附。一般来说，推荐吸附方法，涂覆更一致和方便，但手工涂布在特殊情况下也有其优势。

手工涂布

Cell-Tak蛋白质可通过机械涂布的方式沉积在玻璃或塑料表面上。使用玻璃棒或微量移液器尖端，将溶解在5%醋酸中的Cell-Tak按微升体积均匀地涂布。随着醋酸的蒸发，留下一层Cell-Tak的涂层。经过乙醇和水的清洗后，即可使用。虽然涂层不如吸附方法均匀，但在特殊情况比较方便，例如仅需要涂覆容器或玻璃载玻片的一部分时。

吸附法涂布

吸附法涂布是应用Cell-Tak蛋白质最简单、经济的方法。当pH升高时，Cell-Tak会从溶液中析出并自发地吸附到首次接触的表面上。所得到的涂层非常薄（可能接近蛋白质单分子层）且比手工涂布得到的涂层更加均匀。

具有以下优点：

●涂覆任何形状的容器都很简单。

● 每平方厘米表面积所需的Cell-Tak较少。

●更大的灵活性，可以调整初始浓度和吸附时间，以最适合特定的实验方案。

使用吸附方法时应注意以下几点：

1) 吸附在改变pH后便立即开始，因此在将Cell-Tak稀释为中性缓冲液后，应在10分钟内使用。

2) 由于Cell-Tak在2-8℃的5%醋酸中储存效果最佳，因此只有在使用时才将储备溶液稀释。如果稀释液为水，则当天使用；如果稀释液为中性缓冲液，则立即使用。

3) pH是调节吸附的最重要变量（最佳pH为6.5-8.0）。虽然大多数缓冲液可以用于中和Cell-Tak，但碳酸氢钠效果最好。如果需要，可以添加相当于Cell-Tak用量一半体积的1N氢氧化钠与中性缓冲液混合，以使溶液达到中性pH。

4) 避免通过受污染的移液器或其他方式将中性缓冲液引入Cell-Tak储备溶液中。储备溶液的污染会导致Cell-Tak沉淀在储备瓶表面，从而导致产品损失。

涂层包被过程

1) 准备中性缓冲溶液。建议制备0.1M的pH值为8.0的碳酸氢钠溶液，用于消毒涂层。将缓冲溶液进行过滤灭菌。

2) 计算所需的Cell-Tak量。根据要涂覆的容器的大小和数量，计算总表面积。最佳的Cell-Tak密度取决于您的具体应用或细胞类型。建议进行初步的剂量-反应实验来确定最佳密度。否则，可以从3.5 µg/cm²的Cell-Tak密度开始。高密度不一定会改善性能，因此应通过实验证明“最小有效密度”。

3) 中和Cell-Tak蛋白质并分装到容器中。缓冲液的确切体积取决于是否要涂覆容器的侧面。将正确量的Cell-Tak稀释到缓冲液中，彻底混合，并在10分钟内分装。

注意：如果涂覆缓冲液的pH不在6.5-8.0之间，Cell-Tak的性能将不佳。达到这个pH范围的助剂是使用相当于Cell-Tak溶液体积一半的1N氢氧化钠与中性缓冲液混合。例如：使用10 µL的Cell-Tak、285 µL的pH为8.0的碳酸氢钠溶液，以及5 µL的1N氢氧化钠（在涂覆前立即添加）制作300 µL的Cell-Tak溶液。

4) 孵育以进行吸附。建议最低孵育时间为20分钟，但即使所有液体蒸发，较长的时间也不会对吸附产生不良影响。倒掉或吸取Cell-Tak，并用无菌水洗涤以去除碳酸氢钠。如果稍后要使用容器，应将其晾干并在2-8℃下储存最多两周，或使用干燥剂储存最多4周。

具体操作步骤

1) 在无菌条件下进行涂层包被，在层流罩内进行稀释和分装步骤。在吸附过程中，可以将容器瓶盖好并移动到实验台上。Cell-Tak在37℃和室温下都能有效进行吸附。

2) 通过最小化体积来加快吸附速度。只使用足够的缓冲液覆盖容器底部。检查容器底部是否平坦。

3) 在培养瓶或培养皿中加入缓冲液，然后直接加入Cell-Tak。充分混合这两种液体，并在返回Cell-Tak储备瓶之前更换移液器的枪头。

4) 根据有效生长面积而不是培养皿直径来进行计算，以节省试剂。以下是一些常用的Falcon培养产品及其有效生长面积。

表1 Falcon培养产品及其有效生长面积

包被过程（组织培养皿、瓶、载玻片和盖玻片）：

① 计算需要涂覆的总表面积以及所需的Cell-Tak量。确定覆盖容器底部所需的缓冲液体积。

② 对于细胞培养瓶，将无菌缓冲液分配到每个瓶子中，并加入适量的Cell-Tak。充分混合。禁止用中和缓冲液的移液器枪头交叉污染Cell-Tak储备液，因为Cell-Tak会吸附在储备瓶壁上。

③ 对于细胞培养皿：在管中混合缓冲液Cell-Tak，然后分配适量的溶液到每个皿中。

④ 对于玻片或载玻片：将玻片或载玻片放在培养皿底部，并用中和的Cell-Tak溶液覆盖。也可以使用血片技术进行涂层。（血片技术在本部分之后。）允许至少20分钟的吸附时间。

⑤ 倒掉或吸取Cell-Tak溶液，并用无菌水冲洗两次。

⑥ 如果容器需要储存，晾干后在2-8℃下储存。

玻片涂层包被过程（替代方法）

① 确定要涂覆的玻片或载玻片数量；确保清洁无尘和无油脂。

② 将适量的Cell-Tak储备液转移到离心管中，并通过加入四分之一体积的2M碳酸钠中和。由于使用的体积较小，我们已经通过使用2M碳酸钠代替0.1M碳酸氢钠来优化了这种技术。当混合时，溶液会起泡，所以请确保使用空间足够大的离心管。向储备液中加入2-3％的异丙醇可以降低表面张力，并使玻片或载玻片完全覆盖。

③ 将20 µL中和的Cell-Tak放在载玻片中心，将第二个载玻片以45°角，从玻片的一边慢慢放在溶液滴上，然后通过毛细作用使溶液在载玻片之间扩散。通过相互滑动将载玻片分开。

④ 将玻片或载玻片晾干。液体在室温下将在五分钟内蒸发。用蒸馏水清洗玻片或载玻片后使用或者在2-8℃下晾干后储存备用。

多孔板涂层包被过程

① 计算需要涂覆的总表面积以及所需的Cell-Tak量。确定覆盖孔底所需的缓冲液体积。对于孔大的板，将总的缓冲液体积和Cell-Tak混合在离心管中，然后分配到各个孔中。对于小孔（96孔和48孔板），在每个孔中加入适量的Cell-Tak（10 µL）和水。在每个孔中添加至少20 µL的碳酸氢钠缓冲液。至少20分钟的吸附时间。

② 倒掉或吸除Cell-Tak溶液，并用蒸馏水清洗后使用，或在2-8℃下晾干后储存备用。

细胞培养插件涂层包被步骤

① 计算需要涂覆的总表面积以及所需的Cell-Tak量。由于插入物有各种尺寸，请确保在计算中包括正确的表面积。

② 确定填充插入物底部所需的缓冲液体积。

③ 将总体积的缓冲液与Cell-Tak混合在离心管中，并将适量的溶液分配到每个插件中。至少20分钟的吸附时间。

④ 吸除CorningCell-Tak溶液，并用蒸馏水清洗。

⑤ 如果要储存插入物，请晾干后在2-8摄氏度下储存。

细胞Cell-Tak表面的粘附

贴壁和非贴壁细胞在与Cell-Tak涂层表面接触时都会被粘附。可粘附固定细胞以及酵母菌和细菌等微生物。偶尔遇到附着问题的原因是一些细胞（例如脂肪细胞，HL-60）和微生物不容易沉淀。在这种情况下，减少细胞播种的培养基总体积，直到刚好覆盖容器底部。细胞可在含血清的培养基中进行播种，但在添加细胞之前不要将培养基预先加入Cell-Tak涂层容器中。因为血清蛋白可以阻塞粘附位点。为了增加细胞附着动力学，可以尝试在不含血清的培养基中播种细胞。在细胞附着后立即切换到含血清的培养基。

观察到，虽然非粘附细胞会迅速附着到Cell-Tak表面，但它们会在几小时内开始脱落。这种脱落可能是由于细胞膜蛋白的代谢转化或实际的细胞增殖引起的。当非粘附细胞（例如杂交瘤细胞）在Cell-Tak上生长时不会形成离散的群落。

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