【Cytiva】Ficoll 密度梯度离心液——Ficoll-Paque PLUS 密度梯度离心介质

使用Ficoll溶液将血液离心分层后，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集，血浆（Plasma）和血小板由于密度较低, 故悬浮于分层液的上部；PBMC 密度稍低于分层液，故位于分层液界面上形成白膜层；红细胞（RBCs）与粒细胞（Granulocytes）由于密度较大, 故沉于分层液的底部[1,2]。

离心完成后，从管底往上依次为红细胞-粒细胞-Ficoll 细胞分离液-淋巴细胞-血小板-血浆。在取淋巴细胞时要小心将上层的血浆和血小板移除后再吸取淋巴细胞。

Ficoll是用来分离特定密度细胞的分离液（1.077, 1.073 和 1.084 g/mL三款），适于已知密度细胞的分离。可用作从外周血、骨髓及脐带血中分离高活性的单个核细胞（包括淋巴细胞和单核细胞）。

Ficoll-Paque PLUS主要用于人外周血中淋巴细胞的分离，如果待分离的淋巴细胞来自其他的组织/种属，可能无法获得淋巴细胞的最佳产量和纯度，需要对标准操作进行优化。已有在鼠、狗、猴、牛、兔、马、猪甚至鱼淋巴细胞分离上的应用[3]。不满足条件的种属或来源，可以先用 Ficoll 分离出单个核细胞，再加一步 Percoll 来实现最终的分离目的。

Ficoll-Paque™ PREMIUM 是 Ficoll-Paque™ PLUS 的基础上在符合 GMP 的车间生产的，有法规文件的支持（RSF 文件），可以用于细胞治疗和临床研究，PLUS 只能用科研。Ficoll-Paque PREMIUM 有三个密度（1.073,1.077,1.084），Ficoll PLUS 只有 1.077 这一个密度。

通过推荐方法使用Ficoll-Paque™ PreMIUM产品分离正常人类外周血，其产物具有以下特点：

①分离组分的95% ±5%为单个核细胞

②分离细胞活力> 90%

③原始血样中单核细胞的回收率为60% ±20%

④3% ±2%为粒细胞

⑤5% ±2%为红细胞。

Ficoll 已经在 121℃、20 min 进行了灭菌，为无菌状态，建议无菌操作，分次取用。若选择再次灭菌，由于灭菌设备等的差异，没有推荐的灭菌条件。另外如果灭菌时没有保证盖子的密封性和稳定的温度，可能会造成 pH 波动。

Ficoll应避光储存于 4-30℃之间，可以保存3年。开启后建议存储于4-8℃。偶尔短时冷冻，解冻后应来回反复倒置，确保溶液的均一。

用 Ficoll进行人外周血中淋巴细胞的分离时，按照样品：Ficoll 的高度比约为 3:2.4 或体积比 4:3 的比例进行样品和分离液的添加。大体积样品可以通过增加离心管的直径来进行分离。增加离心管直径并不影响所需的分离时间。另外在进行分离时，整个梯度离心要求慢升慢降，需要在离心机里设置加速度，一般有 1 到 9 级可选。Ficoll 升速时没有要求，降速时要慢，建议关闭刹车，设置加速度为 3。

Ficoll可使用塑料管进行分离操作，但不适用于长期储存。Ficoll 有泛影酸钠，需要避光保存，短期（两周内）储存可以用塑料瓶+锡箔纸。

无菌密度梯度离心介质旨在分离人淋巴细胞，用于体外研究。

●即用型无菌密度梯度离心介质，用于从外周血中高效分离人淋巴细胞。

●保持 B 淋巴细胞 和 T 淋巴细胞的活力。

●内毒素水平低 (< 0.12 EU/mL)。

Ficoll-Paque PLUS（密度 1.077g/mL）用于分析研究的单核细胞分离。

（一）试剂制备

平衡的盐溶液。每个待处理样品至少为20 mL。平衡盐溶液可以由两种原溶液A和B制备。

（二）淋巴细胞的分离程序

1、翻转Ficoll-Paque加瓶几次，以确保彻底混合。

2、在离心管中加入Ficoll-Paque PLUS™ （3 mL）。

3、小心地将稀释后的血液样本（4 mL）放在Ficoll-Paque PLUS上（见下图）

重要提示：分层时不要混合 Ficoll-Paque 培养基溶液和稀释的血液样本。

4、离心机400×g，18-20℃，离心30-40分钟（应关闭制动器）。

5、用无菌吸管吸去含有血浆和血小板的上层，在界面处保留单核细胞层。含有血浆的上层可保存起来备用。

（三）洗涤分离细胞

1、估计转移的单个核细胞的体积。在离心管中的单个核细胞中加入至少3体积（~ 6 ml）的平衡盐溶液。

2、将细胞轻轻吸进吸出，使其悬浮。

3、在18°C至20°C下，400至500 × g离心10至15分钟。

注:高速离心可提高单核细胞回收率。但是，如果也需要去除血小板，则建议使用较低的离心速度(60 ~ 100 × g)。

4、除去上清。

5、将单个核细胞重悬于6 - 8ml平衡盐溶液中。

6、离心400至500 × g(或60至100 × g去除血小板)，在18°C至20°C下10分钟。

7、除去上清。

8、将细胞颗粒重新悬浮在适合应用的培养基中。

（四）分离粒细胞的程序

1．使用Ficoll-Paque培养基进行密度梯度离心

2．用无菌移液管抽去Ficoll-Paque培养基的上层，使红细胞层以上的粒细胞白细胞层不受干扰。

3. 用移液管收集粒细胞薄的白色细胞层，转移到无菌离心管中。

4．将细胞重悬于至少5体积的平衡盐溶液中，400 × g离心15分钟。

5．用任意红细胞溶解溶液溶解剩余的红细胞。

6．在18°C ~ 20°C条件下，400 ~ 500 × g离心10 ~ 15 min。

7．除去上清。

8．将粒细胞重新悬浮在6 - 8ml平衡盐溶液中。

9．在18°C至20°C下，400至500 × g离心10分钟。

10．除去上清。

11．将细胞颗粒重新悬浮在适合应用的培养基中。

参考文献

[1]Isolation of mononuclear cells and gr anulocytes from human blood. (Paper IV). Bøyum, A., Scand. J., Clin. Lab. Invest. 21 Suppl, 97, 77–89 (1968).

[2] Isolation of leucocytes from human blood – further observations. (PaperII). Bøyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 Suppl, 97, 31–50 (1968).

[3]Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Bøyum, A., Scand. J., Immunol. 5 Suppl, 5, 9–15 (1976).

[4]Cryopreserved mesenchymal stromal cell treatment is safe and feasible for severe dilated ischemic cardiomyopathy, Chin et al., Cytotherapy, 12, 31-37 (2010).

[5]Mesenchymal stem cells from multiple myeloma patients display distinct genomic profile as compared with those from normal donors, Garayoa et al., Leukemia, 23, 1515-1527 (2009).

[6]GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion, Grisendi et al., Cytotherapy, 12, 466-477 (2010).

[7]Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials. Brooke et al., British J. of Haematology, 144, 571-579 (2008)

[8]Isolation of bovine colostral lymphocytes: in vitro blastogenic responsiveness to concanavalin A and bovine rotavirus. Archambault, et al., Ann. Rech. Vet., 19, 169-174 (1988).

[9]Characterization and species distribution of high affinity GTP-coupled receptors for human rantes and monocyte chemoattractant protein. Van Riper et al., JEM, 177, 851-856 (1993).