【Cytiva】WB实验操作流程

注意：使用去离子水或者双蒸水配制相关buffer。

1. 样本中加入loading buffer，加热样本至95°C，5分钟。

2. 上样前为去除聚集体或者颗粒，一般使用12 000 × g，2-5分钟对样品进行离心。

3. 将胶放在电泳仪中，加入适量的跑胶缓冲液。

4. 拔去凝胶中的梳子，让跑胶缓冲液没过每个上样孔。

5. 在样品孔中加入适量样品和彩虹marker。

6. 盖上电泳仪盖子，将电泳仪插孔插入电源，保证整个过程中黑对黑，红对红。

7. 跑胶。一般是浓缩胶80V，分离胶100V-120V。

8. 当溴酚蓝跑出凝胶下缘时，关掉电源，拆掉电泳装置取出凝胶板。

9. 去掉凝胶中的浓缩胶部分，将分离胶切角以记录凝胶方向。

接下来的步骤适用于湿转。

10. 在转印之前，将凝胶和PVDF膜放在预冷的转印缓冲液中平衡10至15分钟。

11. 将电转夹放入装有预冷的转移缓冲液托盘中，组装转移三明治，使蛋白质向膜迁移。

12. 将预先润湿的海绵放置在电转夹中，玻璃棒轻轻按压以除去气泡。

13. 将三张预先润湿的滤纸放在海绵上，玻璃棒轻轻按压以除去气泡。

14. 将膜放在滤纸上，玻璃棒轻轻按压以除去气泡。

15. 将凝胶放在膜的上面。在凝胶上放置另外三张预湿的滤纸。玻璃棒轻轻按压以除去气泡。

16. 最后将预先润湿的海绵放在最上面，玻璃棒轻轻按下以除去气泡，最后将夹子加紧。

17. 将预冷的转移缓冲液添加到转印装置中。

建议！在转印过程中添加磁搅拌子使缓冲液循环。

18. 将三明治的架子放入转移装置中。将转移装置连接到电源，转印通常是100V，1h。（转印具体参数需要根据蛋白特性和仪器说明书进行。）

19. 转移后，在适当的封闭溶液中将膜在室温下封闭1小时。

20. 封闭后，进行一抗孵育，通常在室温1h或4°C过夜。

21. 孵育后，需要对膜进行洗涤。使用含有Tween-20的磷酸盐缓冲盐水（PBS-Tween）或含Tween-20的Tris缓冲盐水（TBS-Tween）对膜进行洗涤，通常情况下是，每次洗涤5min，洗涤3次。

22. 洗涤完后，在室温下进行二抗体孵育1h。

23. 二抗孵育完后，通常在PBS-Tween或TBS-Tween中将膜洗涤3次，每次5分钟。

24. 根据所选检测系统的说明书进行蛋白质检测。

㈠哺乳动物蛋白质提取

以下操作步骤我们以GE Mammalian Protein Extraction Buffer为例来介绍。这是一种特别适用于从哺乳动物细胞中提取蛋白质的溶液，适用于粘附细胞和悬浮细胞。

建议:

根据应用，可以将二硫苏糖醇（DTT）和乙二胺四乙酸（EDTA）加入缓冲液中。

在提取过程中添加蛋白酶抑制剂混合物。使用预冷的缓冲液并在冰上工作。

A、细胞悬液中蛋白的提取

1. 3000×g5分钟离心，去除并丢弃上清液。

2. 用5至10 mL预冷的PBS洗细胞一次。离心去除PBS清洗液。

3. 加入Mammalian Protein Extraction Buffer并悬浮细胞。对于每10mL悬浮物，加入1mLMammalian Protein Extraction Buffer。或者，每0.05g细胞加入1mLMammalian Protein Extraction Buffer。

4. 用移液管悬浮细胞，直到达到均一的悬浮液。将裂解物在冰上孵育15至30分钟。期间定期摇动或短暂涡旋悬浮液。

5. 在冷冻离心机中以20000×g离心裂解物30分钟。收集裂解液用于下游处理和分析。

B、铁壁细胞蛋白的提取

1. 对于贴壁细胞，首先弃掉培养基。

2. 用PBS洗涤细胞一次。弃掉PBS。

3. 加入适量的Mammalian Protein Extraction Buffer以覆盖细胞培养表面（表1）。或者，确保细胞可以从培养板上被刮下，

4. 并在后续步骤中将细胞作为悬浮细胞处理。

表 1 提取贴壁细胞需要用Mammalian Protein Extraction Buffer的体积

5. 轻轻摇动培养板10分钟，接着使用细胞刮将细胞轻轻地从平板上取下。裂解物，包括细胞碎片，可直接使用。或者，将裂解物转移至离心管中，以20000×g离心30分钟。收集澄清的裂解液用于下游处理和分析。

㈡样品除杂 SDS-PAGE Clean-Up Kit

SDS-PAGE除杂试剂盒用于制备由于高导电或低蛋白浓度而难以分析的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品。

该方法的工作原理是定量沉淀蛋白质，同时将干扰物质如洗涤剂、盐、脂类、酚类和核酸留在溶液中。

然后将蛋白质与SDS-PAGE loading buffer混合重新并重悬。该操作可在2小时内完成，定量收率高。

该试剂盒可以处理50个样品且每个样品的含量为100μl。该试剂盒可以扩大到更大体积或更稀释的样品。

实验所需要的材料：

· 1.5毫升离心管

· 冷冻离心机，可以提供 12000×g及以上的动力。

· 旋涡混合器

· β-巯基乙醇或DTT

· 95°c样品变性金属浴

前期准备：

开始操作前，将清洗缓冲液置于-20°C至少1 h。清洗缓冲液可储存在-20°C的冷冻室中。

向sample loading buffer中添加还原剂。还原剂可以是DTT或β-巯基乙醇。如果使用DTT，每100μl SDS-PAGE sample loading buffe添加3.1 mg，并确保完全溶解。如果使用β-巯基乙醇，每100μl sample loading buffer添加5μl。加入还原剂后，应立即使用sample loading buffer。或者可将sample loading buffer，可在-20°C下进行分装和储存。

蛋白样品应不含颗粒物质。必要时通过离心澄清。

在1.5 ml微量离心管中处理蛋白质样品。除非另有规定，否则所有步骤均应在冰上进行。将离心管放置在离心机中，使离心管盖子朝外。这样，样品将始终位于管的同一侧，最大限度地减少损失。

具体操作步骤：

1. 将1至100μl蛋白样品（含1μg至1 mg蛋白质）转移到1.5 ml微量离心管中。

2. 加入300μl沉淀剂（标为“1”），旋涡或反转混匀。在冰上孵育15分钟。

3. 在蛋白质和沉淀剂的混合物中加入300μl共沉淀剂（标记为“2”）。短暂的涡流混合。

4. 以最大速度（至少12000×g）在离心机中对管进行离心5分钟。离心完成后立即将管从离心机中取出。管壁上小颗粒应该是可见的。快速进行下一步，以避免颗粒再悬浮或分散。

5. 小心移液尽可能除去上清液。不要搅动沉淀。

6. 小心地将管子重新放置在离心机内，使离心盖子统一朝外。再次对管子进行离心，短暂的离心即可。用微量移液管除去剩余的上清液，使得管子中不应残留可见液体。

7. 用移液管将25μl水加到每个颗粒的顶部。每管旋转5到10秒。颗粒应分散，但不溶于水。

8. 添加1ml洗涤缓冲液（标记为“3”），在-20°C下放置至少1小时，以及5ul洗涤添加剂（标记为“4”）。旋涡直到颗粒完全分散。

9. 将离心管在-20°C下孵育至少30分钟。每10分钟旋涡20到30秒一次。

10. 以最大速度（至少12000×g）在离心机中离心管5分钟。

11. 小心地取出并丢弃上清液。一个白色的颗粒应该是可见的。让颗粒短暂风干（不超过5分钟）。干燥时间不要超过5分钟，如果太干，很难再悬浮。

12. 用5至40μl缓冲液I重悬颗粒（标记为“5”）。短暂涡流，在冰上孵育5分钟。

13. 步骤12中使用l缓冲液I每5μ添加1μl缓冲液II（标记为“6”）。短暂涡流，在冰上孵育5到10分钟。

14. 添加等量（6至48μl）的加入还原剂（DTT或β-巯基乙醇）（见前期准备）SDS-PAGE样品缓冲液（标记为“7”），如果溶液变黄，则以0.5μl的增量添加缓冲液I，直到溶液变蓝。

15. 将样品颠倒混匀5至10 s，在室温下孵育5至10 min。将样品管置于95°C金属预中煮3 min。

16. 对管进行短暂的离心，短暂即可。轻敲管子，确保内容物混合均匀。样品现在可以准备上样了。用GE公司的2-D Quant Kit试剂盒可以准确测定样品中的蛋白质浓度。

㈢使用2-D Quant试剂盒测定蛋白浓度

2-D Quant 试剂盒是专门为在电泳前准确测定样品中蛋白质浓度而设计的。该分析对体积在1到50μl之间的高达50μg的可溶性蛋白质。

具有线性响应。该方法与常用的样品制备试剂（如2%SDS、1%DTT、8 M尿素、2 M硫脲和4%的3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基氨]-1-丙磺酸酯（Chaps）兼容，给你的蛋白定量准确性保驾护航。

实验所需要的材料：

--沉淀剂、共沉淀剂、铜溶液、彩色试剂A和B，和牛血清白蛋白（BSA）标准溶液（试剂盒提供的。）

--2ml离心管

--旋涡混合器

--离心机

--可见光光度计

具体操作步骤：

1. 制备适量的工作颜色试剂，将100份色剂A与1份色剂B混合。

每个单独的分析需要1毫升工作颜色试剂。工作颜色试剂可在4°C至8°C下储存1 周或只要溶液的光密度（OD）在480 nm下保持在0.025以下都可以。

2. 将BSA标准溶液（2 mg/ml）加入6个试管中，制备标准曲线，最终量为：0（空白）、10、20、30、40和50μg。

3. 制备待分析样品。在单独的试管中添加1至50μl待分析样品。调整此体积，确保在分析的工作范围内添加一定量的蛋白质（0.5至50μg）。

4. 每管（包括标准曲线管）加沉淀剂500μl。短暂旋转，在室温下静置2到3分钟。

5. 在每管中加入500μl共沉淀剂，通过旋涡或反转进行短暂混合。

6. 对试管进行至少10000×g离心5分钟。使用tip头丢弃上清液。建议增加一个短暂离心，然后用微量tip头除去任何残留的上清液。

7. 每管加入100μl铜溶液和400μl水。短暂旋涡以溶解沉淀的蛋白质。

8. 每管加100μl工作颜色试剂。尽可能快地加入试剂，确保即时混合。颠倒混匀，室温孵育15-20分钟。

9. 以水为参考，在480 nm处读取每个样品和标准品的吸光度。吸光度应在加入工作色试剂后40分钟内读取完毕。

10. 通过绘制标准品对蛋白质量的吸光度，生成标准曲线。用这个标准曲线来测定样品的蛋白质浓度。

通用PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）实验步骤：

1. 加入sample loading buffer，在95°C下煮样5分钟。

对于变性和还原条件下的PAGE：向sample loading buffer中添加SDS和还原剂。

对于变性条件下的PAGE：向sample loading buffer添加SDS。

对于 Native胶：无SDS，无还原剂，无加热！

样品加入sample loading buffer煮沸后，可以在-20°C下保存3至4周或在4°C下保存1 周。在分析前将样品加热至37°C几分钟，以使沉淀的SDS再溶解。

上样前，务必检查蛋白质浓度。

2. 将凝胶放入电泳设备中，加入适当的缓冲液。

3. 取下梳子，使缓冲液没过上样孔。

4. 将样品和marker加入到凝胶孔中。

上样前，将所有样品离心12000×g 2至5分钟，以去除任何颗粒物。

建议用sample loading buffer补满未加入样品或者marker的泳道。

5. 将盖子盖上，并将插头黑对黑红对红插入电源插座中。

6. 在适当的条件下跑电泳。一般情况下, 80V浓缩胶，120V分离胶。

7. 当染料到达凝胶底部时，关闭电源，断开导线，取下盖子。

8. 将凝胶从电泳装置中取出，进入下一步。

㈠SDS-PAGE胶的制备

制胶过程中用的 buffer：

--4× resolving gel buffer (1.5 M Tris-Cl, pH 8.8):

--4× stacking gel buffer (0.5 M Tris-HCl, pH 6.8)

--10% SDS

--10% ammonium persulfate (APS)

制胶的基本流程：

1. 在制胶单元上组装玻璃板，使用适当厚度的垫片来确定最后的上样量。

2. 在玻璃瓶中依次加入制作分离胶所需的各项缓冲液（见表2），先不要加入APS和TEMED。

3. 使用tip头反复吹吸，使得各项缓冲液混匀，尽可能不要引入气泡。

4. 加入Temed和APS，轻轻旋转玻璃瓶，注意不要产生气泡。

5. 用移液管将混好的分离胶加入到胶板中。

6. 在分离胶上立即加入纯水或异丙醇或乙醇，将凝胶压平。当凝胶聚合时，可以看到非常尖锐的液体-凝胶界面。

7. 在玻璃瓶中依次加入各项buffer（见表3）制备浓缩胶，先不加APS和TEMED。

8. 待下层分离胶凝固后，将覆盖层纯水或异丙醇或乙醇倒掉。必要时可以用滤纸吸取残余液体。

9. 在玻璃瓶中加入50μl的10%APS和10μl的TEMED。轻轻混匀，注意不要产生气泡。

10. 用移液器将浓缩胶加在分离胶上方，注意不要产生气泡。

11. 小心地将梳子放入未聚合的凝胶中，静置等待凝胶凝固。

凝胶可与梳子一起存放，在4°C的密封袋内用塑料包装紧紧包裹，保持1 周。保持凝胶湿润。

表2  分离胶，40ML

表3  浓缩胶溶液, 10 mL

㈠湿转

所需材料：

· 电泳后聚丙烯酰胺凝胶

· PVDF膜或者NC膜

· 四片WHWMAN×3毫米滤纸，切割成与凝胶相同的尺寸

· 两个泡沫垫

· 转印模块，电源

· 100%甲醇

· 水

· 转移缓冲液：25 mM Tris base, 192 mM glycine, ≤ 20% (V/V) methanol, pH 8.3 在使用前，转移缓冲液需预冷。

转印步骤：湿转

1. 准备足够的转移缓冲液，转印缓冲液需提前预冷。

2. 电泳后，凝胶切角以辨认方向。

3. 将凝胶在转移缓冲液中平衡10至15分钟。记住，凝胶的不完全平衡可能导致条带弥散。

4. 根据制造商的建议，对膜进行裁剪、预湿和平衡。

对于PVDF膜，需在甲醇中预湿15 s，然后用水润湿。在转印缓冲器中平衡至少10分钟。

对于NC膜，在转移缓冲液中平衡至少10分钟。

5. 在转移缓冲液中浸泡滤纸和泡沫垫。

6. 将转印盒放在托盘中，托盘中预先加入转印缓冲液。

7. 转印盒从阳极（+）侧开始，依次放入泡沫海绵，两个滤纸，制备的膜，凝胶，两个湿滤纸，第二个泡沫海绵。

确保滤纸、凝胶和膜之间有气泡。

8. 在转印装置中放置搅拌子。

9. 将夹紧的转印三明治，确保无气泡，放在转印装置中，黑对黑，红对红。

10. 将转印装置黑对黑红对红接到电源上。

11. 根据制造商的建议进行转移。通常是恒压100V 1h。

12. 转移后，从转印三明治中取下薄膜，从薄膜上切一个角以便定位，然后在PBS或TBS中短暂冲洗。

图1 湿转系统

㈡半干转

所需材料：

· 电泳后的聚丙烯酰胺凝胶电泳

· PVDF膜或者NC膜

· 至少6个3毫米滤纸，切成与凝胶相同的尺寸

· 半干转印仪、电源

· 100%甲醇

· 水

· 转移缓冲液：25 mM Tris base, 192 mM glycine, ≤ 20% (V/V) methanol, pH 8.3 在使用前，转移缓冲液需预冷。

转印步骤：半干转

1. 用水冲洗半干转印仪的阳极（+）和阴极（-）。

2. 电泳后，凝胶切角以辨认方向。

3. 从凝胶中除去浓缩胶和溴酚蓝染料前端。

4. 将凝胶在转移缓冲液中平衡10至15分钟。记住，不完全平衡的溶解凝胶可能导致条带弥散。

5. 将至少六片滤纸切成与凝胶相同的尺寸或稍小。

6. 用转移缓冲液浸泡至少三张滤纸。滤纸一个接一个置于下电极（阳极[+]）的中心，然后用干净的吸液管或滚筒从

中心向边缘滚动，以除去所有的空气。

7. 将膜切割成与凝胶相同的尺寸或稍小。预湿并在转移缓冲液中平衡膜至少10分钟。

在转移缓冲液中平衡之前，PVDF膜必须在甲醇中预湿并在水中冲洗。在平衡之前，硝化纤维素膜应在水中预先湿润。处理膜时务必戴上干净的手套，以避免留下指纹。

8. 将预湿膜放在滤纸上。

9. 将凝胶放置在膜上。然后用干净的吸液管或滚筒从中心向边缘滚动，以除去所有的空气。

10. 用三层湿滤纸覆盖凝胶。小心堆叠每层，边缘平行。每层添加后，从中心到边缘滚动干净的吸液管，去除所有的气泡。

11. 将转印装置上层盖上，将彩色导线连接到电源上。黑对黑，红对红。

12. 根据制造商的建议设置半干传输通常在恒定电流下进行。转印时间通常约为1小时。

图2  半干转系统

如果蛋白检测目标本身是磷酸化，不要使用PBS作为blocking稀释缓冲液-使用TBS。

如果使用生物素化或刀豆球蛋白结合作为抗体检测，不要使用脱脂牛奶作为封闭剂。

如果蛋白检测目标物被磷酸化，不要使用粗蛋白制剂作为封闭剂。

注意，并非所有的封闭剂都与荧光蛋白印迹法兼容。Amersham ECL Prime Blocking Agent 建议可以用于荧光检测western。

具体操作步骤：

1. 摇动粉末块，确保成分均匀。

2. 称出适当量的封闭剂，配置溶液使得浓度为2%(w/v) (Amersham ECL Prime Blocking Reagent) 或5% (w/v) (Amersham

ECL Blocking Reagent）。

3. 加入适量PBST或TBST，用力摇动，搅拌15分钟，直到所有成分完全溶解。

制备的封闭溶液可在2°C至8°C下储存，但应在24小时内使用。

3. 将膜置于封闭溶液中，在室温下孵育1h，如果背景持续过高，可以尝试在37°C下孵育1h。或者，如果方便的话，膜可以在2°C到8°C的温度下在封闭溶液中过夜。

5. 在清洗缓冲液中短暂冲洗膜。

㈠化学发光（以Amersham ECL, Amersham ECL Prime, and Amersham ECL Select为例）

1. 用PBST/TBST稀释一抗，具体稀释倍数需要经过优化。

2. 将膜（蛋白质面朝上）放入一抗溶液中，并在室温下孵育1 h或者4℃过夜，请参考抗体说明书。

3. 在PBST/TBST中清洗膜三到六次，每次清洗5分钟。

4. 将膜置于PBST/TBST稀释的二抗中，通常在室温下孵育1h，请参考抗体说明书。

5. 将膜放入PBST/TBST中，每次洗涤4至6次，每次洗涤5分钟。

6. 按照所选检测试剂和成像系统的建议继续检测。

基于Ai680 CCD成像系统

1. 让检测溶液平衡到室温。

2. 混合等量的检测溶液A和B，使总体积足够覆盖膜。一般需要0.1 ml/cm²的膜体积。

3. 将膜从洗涤液中拿出，并将其蛋白质面朝上放在检测托盘内。用移液管将混合检测试剂加到膜上。

4. 在室温下孵育1分钟（Amersham ECL）或5分钟（Amersham ECL Prime和Amersham ECL Select）。

5. 将样品盘放入Ai680成像仪中，按说明书操作。选择曝光时间并拍摄图像。

根据预期信号强度选择曝光时间。建议从1分钟开始，然后调整时间以找到最佳曝光。或者，可以使用累积曝光，可以固定时间叠加一定数量的图片。

㈡荧光检测（Amersham ECL Plex）

1. 在洗涤液或封闭液中稀释小鼠或兔源性一抗至最佳浓度。

2. 用稀释的一抗孵育膜（蛋白面朝上）室温下1.5小时，或4°C下过夜。

3. 在室温下洗膜，每次5分钟，共洗3次。

4. 稀释ECL-Plex-CyDye结合二抗（以1μg/ml的浓度制备）至最佳浓度。

5. 将清洗过的膜在二抗溶液中在室温下孵育1h。确保薄膜不受光照。

6. 在室温下洗膜，每次5分钟，共洗3次。保护膜不受光照。当使用荧光标记抗体时，应在避光处理。

7. 用激光扫描仪扫描膜，检测二抗信号。

㈢多通道荧光检测

1. 一抗使用PBST或TBST稀释。

在单一溶液中可混合一种以上抗体以进行多重检测。

为了防止串扰，不同种一抗必须来源于不同物种。如果使用化学发光检测，则对感兴趣的蛋白质必须在电泳中进行

很好的分离。

如果一抗要重复使用，建议一抗还是分别孵育。

2. 将膜（蛋白质面朝上）放入一抗溶液中，室温下孵育1h或4°C下过夜。

3. 在室温下洗膜，每次5分钟，共洗3次。

4. 稀释二抗，具体比例需要优化。

5. 将膜置于混合的二抗溶液中，在室温下培养1h，保护膜不受光照。

当使用荧光标记抗体时，应在黑暗中孵育。

6. 在室温下洗膜，每次5分钟，共洗3次。保护膜不受光照。

7. 用荧光激光扫描仪扫描细胞膜，检测二抗信号。

如果计划剥离和再杂交，PVDF膜比NC膜更坚固，因此建议使用NC膜。

㈠在高PH和高温下进行剥离

1. 将膜浸入剥离缓冲液（100 mM β-巯基乙醇，2%SDS，62.5 mM Tris-HCl【ph 6.7】），在70°C下孵育30分钟，期间不停搅动。

较低的温度（50°C到70°C）也可能很好地工作，但这应该通过使用抗体的经验来确定。

2. 用PBST或TBST在室温下用大量洗涤液洗涤膜两次，每次洗涤10分钟。

3. 在室温下，在合适的封闭溶液中封闭膜1小时。

4. 重复孵育和检测。

㈡在低PH下进行剥离

1. 将膜浸入剥离缓冲液（100 mMβ-巯基乙醇，1%SDS，25 mM甘氨酸HCl[ph 2.0]）中，孵育30分钟，期间不停搅动。

2. 用PBST或TBST在室温下用大容量洗涤液洗涤膜两次，每次洗涤10分钟。

3. 在室温下，在合适的封闭溶液中封闭膜1小时。

4. 重复孵育和检测。

㈢在高PH下进行剥离

1. 将膜浸入0.2 m NaOH中，在室温下孵育5分钟，期间不停晃动。

2. 取出并加入0.2 m的新鲜NaOH，再培养5分钟。

3. 用水冲洗5分钟。若仍有信号残留，则将NaOH浓度增加至2 M，培养时间增加至30 min。

4. 重复孵育和检测（一般无需封闭）。

使用NaOH剥离后通常不需要重新封闭。但是，根据NaOH浓度和浸泡时间，可能需要重新封闭。

㈣在高盐下进行剥离

1. 将膜浸泡在添加0.5 m NaCl和0.2%SDS的PBS或TBS中30分钟至2小时。

2. 用水冲洗膜。

3. 重复孵育和检测（一般无需封闭）。

使用盐剥离后通常不需要重新封闭。但是，根据浸泡时间的不同，可能需要重新封闭。