【Cytiva】WB实验之化学发光蛋白质印迹法

在细菌中生产重组蛋白的过程必须提供高纯度和高产量。在评估替代生产方法时，通常更重要的是比较产量或确认色谱组分中感兴趣的蛋白质的存在，能够在不同的蛋白质纯化步骤中检测和监测杂质和污染物也非常重要。

例如，在扩大蛋白质生产过程之前，了解某些参数的变化如何影响最终产量是很重要的。在下面的例子中，GE的研究人员研究了不同的诱导温度对重组组氨酸标记绿色荧光蛋白（GFP）在大肠杆菌中产生的产量的影响。

纯化后，利用Western blotting利用Amersham ECL检测测定蛋白质产量，以评估温度变化对蛋白质产量和批次一致性的影响（图1）。

Sample:Purified recombinant histidine (His)-tagged GFP

Marker:Full-Range Rainbow Molecular Weight Markers

Membrane:Amersham Hybond ECL

(now replaced by Amersham Protran Premium)

Blocking solution:Amersham ECL Blocking Agent

Primary antibody:Mouse anti-histidine

Secondary antibody:ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab

Detection:Amersham ECL

Imaging:Amersham Hyperfilm ECL

Analysis:ImageQuant TL 7.0 (now replaced by ImageQuant TL 8.2)

图1 用Amersham ECL和Amersham ECL检测重组组氨酸标记gfp，比较不同诱导温度（20°C或37°C）和纯化介质（Histrap HP，1 ml或Hitrap Capto Q，5 ml on_ktaexplorer）后的蛋白质产量。对纯化结果的目视分析表明，在20℃的诱导温度和对Hitrap Capto Q的纯化条件下，组氨酸标记的gfp的产率最高。

低丰度蛋白检测：监测信号通路激活

在临床前的研究中，培养的细胞有时用潜在的药物和生物疗法来研究特定信号通路的激活。翻译后修饰(PTMS) 的发生率，如蛋白磷酸化，表明了这种途径的激活。然而，与本体蛋白质相比，磷酸化形式的蛋白质通常以非常低的水平存在。为了能够检测更广范围的蛋白，因此，需要一种非常敏感的检测方法。利用化学发光的Amersham ECL Prime进行Western blotting和检测，可以为高灵敏度和宽线性动态范围的应用提供了一种实用的方法。

Stat3是一种参与宿主免疫的转录因子。蛋白质的活性由细胞因子调节，如干扰素α（IFN-α）。用IFN-α刺激细胞会导致STAT3上两个特异性酪氨酸残基的磷酸化，导致同二聚体或异二聚体的形成，这些同二聚体或异二聚体易位到细胞核并启动转录。

在下面的应用实例中，用IFN-α处理后，在hela细胞中评估stat3的磷酸化。从Hela细胞（IFN-α处理和未处理对照组）提取的溶解物样本应用于SDS-PAGE，然后使用磷酸化的Stat3特异性抗体进行Western blotting。使用Amersham ECL Prime（图2）检测磷酸化的STAT3（pstat3），并使用ImageQuant LAS 4000 Mini（现在已由基于CCD的Amersham Imager 680替代）成像。然后剥离细胞膜，重新培养actin蛋白（一种内参蛋白质）。通过监测actin蛋白的表达水平，减少凝胶上不均匀导致的样品误差。pstat3水平与相应的actin蛋白水平标准化。

Sample:Lysates from IFN-α-treated and untreated HeLa cells

Marker:Full-Range Rainbow Molecular Weight Markers

Membrane:Amersham Hybond P 0.45

Blocking solution:Amersham ECL Prime Blocking Reagent

Primary antibody:Mouse anti-pSTAT3 (Tyr 705)

Secondary antibody:ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab

Stripping and reprobing

Primary antibody:Mouse anti-actin

Secondary antibody:ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab

Detection:Amersham ECL Prime

Imaging:ImageQuant LAS 4000 mini (now replaced by CCD-based Amersham Imager 680)

Analysis:ImageQuant TL 7.0 (now replaced by ImageQuant TL 8.2)

免疫共沉淀通过选择对感兴趣的蛋白的抗体进行检测。随后，抗体：蛋白质复合物与固体载体结合，如GE的蛋白G MAG琼脂糖珠。捕获珠复合物可以与任何相互作用的感兴趣的蛋白质一起洗脱免疫共沉淀的典型应用是分析生长因子受体激活后的细胞信号蛋白。例如TAK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与转化生长因子-β（TGF-β）受体激活的信号转导。当刺激时，TAK1与第二蛋白TAB1结合并形成功能激酶复合物，进一步进行信号转导。

对未经治疗和TGF-β处理的人前列腺癌细胞（PCU3）的细胞裂解物进行共免疫沉淀。TAK1抗体加入到细胞裂解液中，随后加入蛋白G MAG琼脂糖凝胶。珠子结合细胞裂解液中的TAK1抗体，并能够提取Tak1/Tab1复合物。

TAK 1 /标签1复合物从珠子洗脱，以及总细胞裂解物，加样到凝胶中。TAK1和相互作用蛋白TAB1可从总细胞裂解液中洗脱出来检测到（图3）。

Sample:Cell lysates from untreated and TGF-β treated PCU3 cells

Marker:Full-Range Rainbow Molecular Weight Markers

Membrane:Amersham Hybond P 0.45

Blocking solution:Amersham ECL Prime Blocking Reagent

Primary antibodies:

(A) Mouse anti-TAK1

(B) Rabbit anti-TAB1

Secondary antibodies：

(A) ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab

(B) ECL Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab

Primary antibodies:

(C) Mouse anti-TAK1

(D) Mouse anti-GAPDH

Secondary antibodies:(C, D) ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab

Detection:Amersham ECL Prime

Imaging:ImageQuant LAS 4000 (now replaced by CCD-based Amersham Imager 680)

Analysis:ImageQuant TL 7.0 (now replaced by ImageQuant TL 8.2)