【Cytiva】WB实验流程之化学发光
化学发光、化学荧光、荧光、显色或放射性同位素检测的各种检测方法都可用(图1)。放射性同位素和显色剂已广泛使用多年，但由于处理放射性同位素的安全问题和显色剂的敏感性差，使用方法的情况较少。化学发光和化学荧光技术以及直接荧光技术开始盛行，并且由于提高了灵敏度和更宽的动态范围，现在成为WB检测首选方法。
酶检测方法，如化学发光和化学荧光，需要加入一种试剂，当其与二抗上结合的酶反应时产生自发光。直接荧光的检测在激发二抗荧光基团后，不需要额外的试剂。最常用的酶检测系统是化学发光，基于与辣根过氧化物酶 (HRP) 结合的抗体，该酶在过氧化物存在下催化鲁米诺的氧化，产生自发光。HRP相比其他酶如碱性磷酸酶（AP，表1），有几个优点。HRP更容易与抗体或链霉亲和素（与生物素亲和结合力极强的一种常用的标签）结合，并且可以与不同的化学发光试剂一起使用。为了获得更高的检测灵敏度、更强的光强和持久的信号，基于HRP的检测试剂在持续研发中。这一章将进一步描述。
基于荧光的检测系统使用特定波长的光源激发，而非添加检测试剂，例如激光扫描仪直接检测。
图1GE提供的用于蛋白质免疫印迹检测方法的试剂组合。Amersham ECL Plex由一系列CyDye(Cy3和Cy5)标记的二级抗体组成，不需要其他检测试剂。这些抗体的荧光信号可以使用激光扫描仪或CCD相机直接检测，例如Amerhsam Typhoon 和Amersham Imager。Amersham ECL start、Amersham ECL、Amersham ECL.、Amersham ECL Select是用于化学发光的检测试剂，需要HRP偶联的二抗以产生光信号。
化学发光
自上世纪90年代初以来，GE（Amersham品牌）不断开发化学发光检测系统，这些检测方法现在是最广泛用于蛋白质免疫印迹实验的方法。今天，一系列化学发光检测试剂可用于满足实验需求。
HRP结合的二抗与一抗结合后，特异性结合到膜上的目标蛋白。在加入鲁米诺过氧化物检测试剂后，HRP酶在多步反应中催化鲁米诺的氧化。
该反应伴随着428nm低强度光的发射。在某些化学物质的存在下，发射光可增强到1000倍，更容易被检测到，提高了反应的灵敏度，此过程称为增强化学发光(ECL)。可以使用几种增强剂，最有效的是变性苯酚，尤其是碘苯酚，它增加了HRP反应频率，并帮助电子从鲁米诺转移到酶。信号强度反应酶分子的数量，因此与抗体量成正比，抗体量又与印迹膜上的蛋白量相关。（图2）
图2. Western blotting中增强型化学发光(ECL) 检测原理
ECL试剂的最佳选择取决于实验的要求。例如，使用Amersham ECL start或Amersham ECL，可以快速地检测高丰度蛋白质，并且节约成本。
另一方面，如果需要高灵敏度或准确的定量，推荐使用Amersham ECL Prime或Amersham ECL Select。由于Amersham ECL Prime和Amersham ECL Select发出的信号非常强，提高了蛋白检出的下限。（表1）
当使用基于抗体的检测方法时，一抗的质量和来源，以及它对目的蛋白的亲和力，将在确定检测限以及是否存在交叉反应等方面起很大作用。
抗体应始终以厂家建议的浓度使用，表1列出了Amersham ECL试剂的指导方法。信号一般随抗体浓度增加而增加，但抗体过量也可能导致与膜的非特异性结合。需要花时间来测试不同的抗体浓度。
表1 Amersham ECL start, Amersham ECL, Amersham ECL Prime,以及Amersham ECL Select适用于不同的WB检测，取决于检测灵敏度需求及一抗适用性。
应用 | 一抗稀释度 | 二抗稀释度 | |
Amersham ECL start | 应用验证性分析，以及检测高至中水平内源蛋白 | 1:500 to 1:3000 | 1:5000 to 1:30000 |
Amersham ECL | 用于定性检测及分析以及其他目的蛋白含量高的应用 | 1:100 to 1:5000 | 1:1000 to 1:50000 |
Amersham ECL Prime | 用于高灵敏度检测及宽动态范围的准确定量 | 1:1000 to 1:10000 | 1:50000 to 1:200000 |
Amersham ECL Select | 用于较低蛋白含量水平下的，高灵敏度检测 | 1:5000 to 1:30000 | 1:100000 to 1:300000 |
Amersham ECL start
Amersham ECL start蛋白免疫印迹检测试剂是Amersham ECL产品家族中的化学发光检测试剂。推荐该试剂用于确认性分析和检测高至中水平的内源蛋白。
Amersham ECL start信号持续时间长，能够多次曝光膜，在实验和分析之间留下充裕的时间。因此，该试剂非常适合于X-射线胶片以及CCD相机进行检测，如图3所示。
在两倍稀释的重组β-半乳糖苷酶蛋白系列中，从320ng开始，直至检测到20ng蛋白（图3A）。低背景产生高信噪比，这清楚地表明Amersham ECL start与X射线胶片之间的高兼容性。在NIH/3T3细胞裂解物的2倍稀释系列中，从总蛋白10μg开始，ERK 1/2在低至0.31μg的水平可被检测（图3B）。CCD成像仪可轻易检测出信号，信号强度与曝光时间呈线性关系(曲线未示出)。此外，在蛋白质免疫印迹过程中，同时使用可见的Amersham ECL Rainbow marker蛋白，AI680成像仪的Overlay功能可快速验证蛋白的分子量。
Sample:β-galactosidase protein in a 2-fold dilution series starting at 320 ng protein
Membrane:Amersham Protran Premium 0.45 NC
Blocking:Skimmed milk powder (5% in PBS-T)
Primary Ab:Rabbit anti-β-galactosidase diluted 1:5000
Secondary Ab:HRP-conjugated anti-rabbit IgG diluted 1:50 000
Imaging:X-ray film
Exposure time:5 min
Limit of detection:20 ng (repeatedly)
Sample:NIH/3T3 cell lysate in a 2-fold dilution range from 10 μg total protein
Membrane:Amersham Hybond P 0.45 PVDF
Blocking:Amersham ECL Prime blocking agent (2% in PBS-T)
Primary Ab:Rabbit anti-ERK 1/2 diluted 1:5000
Secondary Ab:HRP-conjugated anti-rabbit IgG diluted 1:50 000
Imaging:Amersham Imager 600 (now replaced by Amersham Imager 680)
Exposure time:5 min
图3 β-半乳糖苷酶蛋白（A）和 ERK 1/2 在 NIH/3T3 裂解物（B）使用 Amersham ECL start 进行 WB 检测的结果。数据表明 Amersham ECL start和X 射线胶片之间的兼容性。成像结果信号强也体现了Amersham Imager 680 这种基于 CCD 成像设备的优点。
该试剂可用于硝酸纤维素（NC）和聚偏氟乙烯（PVDF）膜的检测。抗体应始终以厂家建议的浓度使用，但作为 Amersham ECL start 的指导，一抗和二抗可分别从1:500稀释至1:3000和1:5000稀释至1:30000。
Amersham ECL start的一个优点是稳定性非常好。当在2°C至8°C下储存时，该溶液可使用长达5天，并且仍可与最初检测水平保持相同。另一个优点是保质期长，保质期为18个月，Amersham ECL start WB检测试剂适合于频繁做WB检测的客户。
Amersham ECL
Amersham ECL是世界上第一款商品化的化学发光检测试剂，能够检测低至10pg的蛋白。它是应用较多的方法，特别适合于以下应用：
• 重组蛋白表达的验证
• 高表达蛋白的验证
• 标签蛋白的研究
• 确认性研究 Amersham ECL Prime
Amersham ECL 在检测稀释的转铁蛋白系列中的性能如图4所示。Amersham ECL 也适用于定量蛋白质印迹，但灵敏度低于 Amersham ECL Prime 和 Amersham ECL Select。
图4 使用Amersham ECL对两倍稀释的转铁蛋白进行WB检测，ImageQuant CCD成像仪进行成像。
使用 Amersham Hybond 和 Amersham Protran Premium 膜实现 Amersham ECL 的最佳性能。这些膜应该使用 Amersham ECL 或 Amersham ECL Prime 封闭液进行封闭，以最大程度降低背景。
抗体应始终按照厂家建议的浓度使用，但作为 Amersham ECL 的使用指南，一抗和二抗可分别从1:100稀释到1:5000和1:1000稀释到1:50000（表1）。自发光信号在5到10分钟之后达到峰值，然后缓慢衰减，半衰期约为60分钟，并且可以使用 Amersham Hyperfilm™ ECL 或基于 CCD 相机的成像仪来检测。
Amersham ECL Prime
Amersham ECL Prime 是一种高灵敏的检测试剂，其特点是信号极其稳定，允许重复曝光，在同一次实验中更容易处理多个印迹。信号强意味着Amersham ECL Prime 适合于处理低丰度蛋白质。此外，可以使用高稀释度的一抗和二抗，降低实验的总成本以及最大程度降低高背景的风险。
与其它化学发光试剂相比，Amersham ECL Prime 的性能得以提高，这是由于存在高性能增强剂和催化剂，提高了信号强度、灵敏度和持续时间。Amersham ECL Prime 特别推荐用于定量分析，例如：
• 需要高灵敏度的应用
• 蛋白丰度的变化
• 蛋白质：蛋白相互作用
• 检测蛋白质异构体
• 蛋白质降解的评价
• 翻译后修饰（PTM）
• 同时检测低丰度和高丰度蛋白
Amersham ECL Prime 的性能如图5所示，用于检测二倍稀释系列的 IFNα处理的 HeLa 细胞裂解物中的 pSTAT3，该裂解物来自 12.5μg 的总蛋白提取物。注意，灵敏性水平取决于特异性抗体与蛋白的相互作用。
图5 应用 Amersham ECL Prime 检测 IFNα处理的 HeLa 细胞中的 pSTAT3。注意，蛋白数量是指从细胞裂解液中提取的负载蛋白的总量。pSTAT3 仅包含该总量的一小部分。对照通道含有 6.25μg 未处理细胞的总蛋白。
灵敏度和准确度
如果与 Amersham Imager 680 系列CCD成像仪结合使用,借助 Amersham ECL Prime 的灵敏度和线性动态范围，可在单次曝光后同一印迹上检测并精确定量低丰度和高丰度蛋白。Amersham ECL Prime 可帮助进行高灵敏度化学发光检测，例如用于检测瞬时蛋白磷酸化(PTM)。
Amersham ECL Prime 的另一个优点是信号强，可使用高稀释度抗体（图6）。如果用于检测的抗体量稀少，Amersham ECL Prime 将节约成本。
图6 Amersham ECL Prime蛋白免疫印迹法检测NIH 3T3全细胞裂解液中β-catenin，采用兔抗β- catenin（一抗）和HRP偶联抗兔IgG（二抗）不同稀释度的二倍稀释系列。注意，蛋白数量是指从细胞裂解物中提取的负载蛋白质的总量。β- catenin 只占总量的一小部分。
信号持续时间
Amersham ECL Prime信号持续时间长，即使在添加底物3小时后测试最低的蛋白量，也仍然发出较强的信号(图7和图8)。因此可实现多次曝光，并且在添加试剂和信号检测之间留有充裕的时间。
图7 2.5ng转铁蛋白的二倍稀释系列，最长检测至加入Amersham ECLPrime 试剂后3小时。时间0对应着发光液加入后5分钟。每个时间点检测信号皆为3分钟。
图8 信号随时间的稳定性。与其他化学发光检测试剂相比，Amersham ECL Prime 的信号持续时间。Amersham ECL Prime 的高稳定性提供了更宽的时间窗，并保持更高的灵敏度。
Amersham ECL Select
当与CCD成像仪结合使用时，并且通过执行类似于Amersham ECL 的优化过程（Amersham ECL Prime 封闭液），Amersham ECL Prime 的性能是最佳的。此外，推荐使用Amersham Hybond PVDF 膜，因为高蛋白结合能力带来高灵敏度。一抗和二抗应分别从1:1000 稀释至1:50,000 和1:50,000 稀释至1:250,000。如果首选暗室压片法，Amersham ECL Prime 也与胶片兼容。
Amersham ECL Select 是另一种类型的高灵敏度的化学发光检测试剂，是Amersham ECL 产品家族中灵敏度最高的检测试剂。Amersham ECL Select 与 Amersham ECL Prime 的检测动态范围是互补的。Amersham ECL Select的卓越信号强度使其适合于最苛刻的WB应用，如微量蛋白的检测。由于光输出与检测到的蛋白量成正比，因而可在单个印迹膜上对强弱信号进行精确定量。
Amersham ECL Select 在WB实验的检测过程中，也会影响上游步骤。例如，如果使用 Amersham ECL Select 进行检测，使用的一抗可被高度稀释。这降低了成本，并且避免背景影响弱信号的检测。Amersham ECL Select特别适用于定量分析，例如:
• 需要高灵敏检测的应用
• 蛋白丰度的变化
• 蛋白与蛋白相互作用
• 检测蛋白质异构体
• 蛋白降解的评价
• 翻译后修饰（PTM）
• 同时检测低丰度和高丰度蛋白质
Amersham ECL Select的性能如图9所示。在293T细胞裂解液两倍稀释系列中检测到内源性TAB 1，起始于总蛋白提取物2μg。注意，灵敏度水平取决于特异性抗体与蛋白的相互作用。
图9 293 T细胞裂解物中内源性TAB-1的免疫印迹检测。Amersham ECL Select 的高信号强度提供更亮的条带和高灵敏度的检测。
灵敏度和准确度
高灵敏度、高信号强度以及宽线性动态范围使得Amersham ECL Select适用于定性和定量分析。Amersham ECL Select产生非常高的光输出，保证了实验中可使用高稀释度的抗体。
图10所示的两倍稀释的NIH/T3T细胞裂解物中PP2A的WB检测表明，在不同的一抗稀释度下，使用Amersham ECL Select可以检测微量的蛋白。
图10 在不同的一抗稀释度下，Amersham ECL Select可以提供高灵敏度
信号持续时间
在检测HeLa细胞裂解液中ERK 1/2的WB印迹模型系统中，评价Amersham ECL Select的信号持续时间。即使在所测试的最低量蛋白中，在加入试剂后2小时仍可获得高信号输出，并有足够的信号强度(图6.11)。这使得实验结束和分析开始之间留有充裕时间，从而可以多次曝光。
图11 在ERK 1/2的两倍稀释系列中，从5μg总蛋白开始，在不同时间点监测Amersham ECL Select信号输出的下降。Amersham ECL Select的高信号强度允许持续检测非常低的蛋白水平，长达2小时。
化学发光实验技巧
●为了提高信噪比，优化封闭液和抗体浓度，从厂家的建议开始。
●不要使用叠氮化钠作为缓冲液的防腐剂，因为它是HRP的有效抑制剂。
●为了在使用基于ECL的检测时避免染色不均匀，首先将检测溶液混合并倒入干净的容器中。然后将孵好的膜置于检测溶液中，轻轻搅拌以覆盖整个表面。
●如果膜要重复使用，把膜放在一个塑料文件袋中，以防止干燥。一定要清除气泡。
●在免疫检测过程中或在两次免疫检测之间任何时候，不要让膜干燥。如果膜干燥，任何残留的分子将永久地结合在膜上，不可能对膜上抗体进行剥离。这在使用PVDF膜时尤其重要。
●为了实验的可重复性，在使用前将所有试剂恢复至室温。
●尽管Amersham ECL, Amersham ECL Prime, 以及Amersham ECL Select 活性较为稳定, 但我们仍建议发光液配好后尽快使用. 如果配好后的发光液需要储存，建议将容器包上锡箔纸，并避光保存。2°C 到8°C下，AmershamECL start可稳定储存5天。
●化学发光信号会逐渐衰减，即便是在ECL检测之后立即分析结果，仍只能得到弱信号：
--确保检测试剂没有过期，并已妥善储存；溶液不应在室温下储存或暴露于直射光
--确保检测溶液瓶上的盖子没有混用，没有污染溶液
--不要交叉污染溶液；使用新的、干净的移液器枪头
●如果你要进行剥离和二次孵育实验，不要让膜变干。
●如果你的检测涉及链霉亲和素-生物素-HRP复合物，不要使用脱脂奶粉作为封闭液或稀释剂。链霉亲和素与生物素之间的相互作用可能被牛奶中的内源性生物素抑制，导致信号降低。此外，牛奶可能含有磷酸表位，会干扰磷酸特异性抗体，并导致背景增加。
●为了检查ECL发光液是否正常，您可以执行“蓝光测试”。暗室中，在试管里加入1mL的ECL试剂，加入1-3μLHRP偶联二级抗体并充分混合，会发出易见的蓝白光。或者点2至5μL的1：100稀释HRP偶联二抗在膜上。加入ECL发光液，将膜放在CCD成像仪或X射线胶片上进行成像。
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