【Cytiva】WB抗体孵育之封闭

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蛋白样品被分离并转移到膜上后，利用抗目的蛋白的抗体进行杂交。通常，蛋白免疫印迹实验使用未标记的一抗特异性结合目的蛋白，再使用标记的二抗与一抗特异性结合。二抗不仅作为标签的载体，还有利于放大信号(图1)，这是蛋白质免疫印迹实验灵敏度高的主要原因。大部分二抗都是多抗，二抗上的标签产生的光信号越强，意味着膜上目的蛋白的含量越高。

通过高特异性免疫检测过程，可在复杂样品中检测到微量的目的蛋白。

图1 由于与酶或荧光基团结合的多个二抗可以结合到一个单一的、特异性的一抗上，所以信号可以大大放大，有助于提高Western Blotting的灵敏度。

蛋白免疫印迹法是通过疏水作用将生物分子固定在膜上。由于抗体与膜也会结合，因此必须“阻断”尚未被蛋白结合的空间。根据蛋白样品及抗体，选择合适的封闭方法，包括封闭液、缓冲液和封闭过程。首先考虑使用厂家推荐的试剂及封闭方法。

蛋白质和非离子洗涤剂是蛋白质免疫印迹实验中常用的两类主要封闭试剂。

用于封闭液的蛋白质

封闭液的蛋白质通常可抑制蛋白质和膜之间的非特异性相互作用，以及蛋白质之间的相互作用，同时也是永久性的阻断剂，因为它们可与膜形成物理连接，并且封闭液对膜的亲和力要强于抗体的亲和力。封闭液应填充所有未占用的结合位点，而不破坏转印蛋白与膜之间的相互结合。

最常用的封闭液包括牛血清白蛋白（BSA）、脱脂牛奶、酪蛋白以及鱼胶（参考表格1）

表格1

蛋白	缓冲液	推荐浓度	适用膜
BSA	Tris-buffered saline (TBS) /phosphate-buffered saline (PBS)	0.2% to 5%(W/V)	NC、PVDF
脱脂牛奶	TBS, PBS	3% to 5%(W/V)	NC、PVDF
Amersham ECL Prime 封闭液(含有脱脂牛奶)	TBS, PBS	2% to 5% (W/V)	NC、PVDF
酪蛋白	TBS, PBS	5%(W/V)	NC、PVDF
鱼胶	TBS, PBS	2% to 10% (W/V)	NC、PVDF

●注意，不同厂家、不同批次脱脂奶粉的含量及质量有所不同。

由于每对抗原-抗体结合都具有特异性，没有单个封闭液是最佳选择。确定最佳的封闭液和浓度是免疫检测成功的关键步骤，合适的条件可提高成像的信噪比，也就是图像质量。低浓度的封闭液可能导致高背景即膜发黑。另一方面，过量的封闭液可以影响抗体和抗原的结合。

●如果未验证出最佳封闭液浓度，首先选择厂家推荐的浓度。

●如果使用生物素或刀豆素结合的抗体，不能使用脱脂牛奶，因为牛奶同时含有糖蛋白和生物素，导致降低信号强度。

●注意，天然蛋白由于含有磷酸酶（它使蛋白质在特定的氨基酸残基上去磷酸化），不适用于封闭磷酸化蛋白。

磷酸化实验中，封闭液中应加入磷酸酶抑制剂。此外，推荐使用TBS作为缓冲液来稀释封闭液，因为PBS中的磷酸盐会干扰磷酸化蛋白与抗体的结合。在磷酸化蛋白质的检测中，不应使用脱脂牛奶作为封闭液，因为牛奶含有酪蛋白（磷酸表位），其可以干扰抗磷酸酪氨酸抗体并导致背景信号增加。

以下蛋白成分的封闭液列表可作为蛋白质免疫印迹实验ECL化学发光检测方法的推荐封闭液。

脱脂奶粉/吐温吐-20：该组合相对便宜，通常将5%脱脂奶粉奶加入到含0.1%吐温-20的PBS来使用。可以得到很低的背景，但注意避免出现假阳性。该封闭液适用于ECL化学发光实验。

脱脂奶粉 :最常见的封闭液。脱脂奶粉很便宜，且背景干净。如果使用浓度为5%的PBS或TBS溶解脱脂奶粉，溶液会迅速变质，而且会出现假阳性，但将降低到1%时，就可以改善信号。

鱼胶：鱼胶比哺乳动物来源的明胶具有更少的氢结合氨基，因此往往具有更低的背景。鱼胶通常使用2%的浓度，40℃以下易于溶解。但是，它含有一些竞争性反应物，如生物素。鱼胶相对昂贵。

BSA：BSA相对便宜，并且对大部分实验都适用。为PBS或TBS稀释至0.3%-3%，0.1%的吐温-20可以在背景较深的情况下选择性添加。磷酸化实验时，建议使用2%浓度的BSA。

血清：常使用10%的马或胎牛血清，溶液含有0.02%叠氮化钠。这种封闭液价格昂贵，并可能出现交叉反应。

封闭液中的洗涤剂

洗涤剂封闭液通常与蛋白质封闭液结合使用，对于强背景信号特别有用。实验室常用洗涤剂(表5.2)。它们是非永久性的阻滞剂，不附着在膜上，很容易在洗涤步骤中去除。通常使用Tween-20溶液，也可以选择十二烷基硫酸钠(SDS)或NP40。

表2. Western blotting 实验中用于封闭液的洗涤剂

洗涤剂	SDS	Tween-20	NP40
推荐浓度	0.02% to 0.05% (W/V)	0.05% to 0.1% (V/V)	0.02% to 0.05% (V/V)
缓冲液	TBS, PBS	TBS, PBS	TBS, PBS
适用膜	NC、PVDF	NC、PVDF	NC、PVDF