【Cytiva】WB凝胶电泳之总蛋白染色

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总蛋白染色

由于蛋白质在凝胶中不能直接可见，所以必须对凝胶进行染色。蛋白质通常用考马斯蓝或银染色。染色后的凝胶，可以使用合适的仪器进行成像（见第7章）来进行永久性记录。所捕获的图像可使用适当的软件进行图像分析。

对转印后的凝胶进行染色，确保蛋白质已经成功地从凝胶迁移到膜。如果蛋白质没有转移到细胞膜上，后续骤无需进行。对于某些应用，在电泳后只需直接分析凝胶中的全部蛋白质，例如，检查蛋白质纯化的质量。预染的另一种方法是在电泳前用荧光化合物标记样品，可以在电泳分离后直接进行成像。

银染：银染色是聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质永久可见染色最灵敏的方法。在银染中，凝胶用可溶性银离子浸渍，并用甲醛处理，从而减少银离子，形成金属银的不溶性棕色沉淀。这种减少是由蛋白质促进的。银染色蛋白可以使用像Amersham 680这样的成像仪系统成像。

考马斯蓝：考马斯蓝染色是基于染料考马斯亮蓝的结合，它结合几乎所有蛋白质都是非特异性的。虽然它比银染色更不敏感，但由于其方便性而被广泛使用；凝胶仅浸入染料溶液中，任何脱胶染料可在脱胶步骤中从凝胶中扩散出来。考马斯蓝染色蛋白可以用Typhoon系列和Amersham 680等系统成像。

荧光预标记：荧光预染蛋白可以耦合蛋白及荧光染料，比如说可以在电转前预标记的CyDye（4）试剂盒。

Amersham QuickStain Kit该试剂盒中包含氟氯烃化合物和一种标记的缓冲液，可用于在断裂后和消除后的蛋白质并且可持久直接检测。此外，过量的Cy5荧光团通过凝胶比蛋白质更快地迁移到终止于凝胶底部，从而消除了凝胶脱胶的需要。有关详细信息，请参见11.2.5中的实验步骤。

图1显示了转移和随后的Western blotting分析前用cy5预标记的细胞溶解物样品的分离。除了快速，它也比银染色更灵敏，并且具有所有染色技术中最广泛的动态范围（图2）。荧光标签可以使用诸如Amersham Taphoon 5和Amersham Imager 680等系统进行分析。

图1 Cy5预标记反应。在室温下，将2.5、5.0、10.0和20.0μg CHO细胞溶解物的三份样品用1μl cy5预标记30分钟。Cy5试剂按1:20稀释，总体积为20μL。

图2 用cy5（a）预标记或用sypro-ruby（b）或coomasse（c）后染色的相同蛋白混合物（300ng）的SDS-PAGE分析。对比SDS页面和成像后的泳道图像，可以发现Cy5预标记提高了灵敏度，降低了背景和噪音水平。

表1 常见的的蛋白染料或标记的属性

蛋白染料或标记	检测方法	检测下线	动态范围
银离子	光密度值荧光成像	~ 1 ng	~10
考马斯亮蓝	光密度值, 荧光成像	~ 10 ng	~10²
SYPRO Ruby	荧光成像r	~ 1 to 2 ng	~10^2.5
CyDye	荧光成像	~ 0.25 ng	~10⁴

参考文献

1. Schägger, H. and von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the separationof proteins in the range from 1-100 kDalton. Anal. Biochem. 166, 368–379 (1987).

2. Wiltfang, J. et al. A new multiphasic buffer system for sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of proteins and peptides with molecular masses 100,000-1000, and their detection with picomolar sensitivity. Electrophoresis 12, 352–366 (1991).

3. 2-D Electrophoresis, Principles and Methods, GE Healthcare, 80642960.

4. Bjerneld, E. et al. Prelabeling of diverse protein samples with a fixed amount of Cy5 for SDS-PAGE analysis, Anal. Biochem. 484, 51–57 (2015).

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