【Cytiva】WB实验中如何确认蛋白转印成功

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电转后，有必要确认凝胶中的所有蛋白质是否完全洗脱，并没有迁移到相反的方向。可以通过Cy5预标记样品或用电转后的总蛋白染色对凝胶进行染色来检测确认。使用可见的（预染色）全分子量marker，如Rainbow Molecular Weight Markers或Amersham-ECL DualvuE Western Blotting Markers，检测转膜效果。当使用Amersham ECL DualVue marker时，该标记物中包含仅在化学发光实验中可检测到的标记蛋白质，帮助检测相同分子量目的蛋白质。

总蛋白染色及标记

除了检查是否完全转移外，总蛋白染色或蛋白预标记也可用于泳道间目的条带的定量比较(表1)。下面列出并简要描述一些常用的染色剂以及如何使用荧光染料进行蛋白预标记。

胶体金

一种对印迹蛋白高度敏感的染色剂，检测限可低至1ng蛋白。胶体金可用于硝化纤维素和PVDF膜。胶体金的低pH值确保了颗粒选择性地与膜上的蛋白结合。使用银增强试剂可进一步增强信号。

考马斯亮蓝

考马斯亮蓝一般用于聚丙烯酰胺凝胶染色，同样适用于膜。用0.1%考马斯染料在45%甲醇和10%乙酸的混合物中溶解，对膜进行染色。然后使用25%甲醇和10%乙酸的混合物对背景进行脱色。

丽春红

为蛋白质印迹提供了一种快速、简便的可逆染色方法，但对于检出限大于250ng的蛋白质的灵敏度较差。丽春红可与硝化纤维素和PVDF膜相容。丽春红染色是观察PAGE胶上蛋白转移到膜上的一种快速、简便的方法。丽春红很容易用水洗脱，被认为是一种“温和”的处理方式，不会干扰随后的免疫检测。注意，当使用PVDF膜结合SDS-PAGE时，确保膜在转印后先在100%甲醇中洗涤，再进行染色，因为丽春红染色液与SDS不相容。

墨汁

便宜且灵敏度较高的方法，且不干扰后续的抗体结合。先在PBS-吐温（0.05%）中对膜进行封闭，再进行染色，可避免高背景。或者在染色液中加入PBS-吐温（0.05%）及1%的乙酸。

酰胺黑

专为膜上蛋白快速染色设计。灵敏度接近于考染，但染色速度更快。它是蛋白质测序和蛋白质原位切割的首选染色剂，用25%异丙醇和10%乙酸可快速脱色蛋白质。

Amersham QuickStain溶液进行Cy5 预标记

电泳前对样品进行Cy5预标记, 可对凝胶上或转印到膜上的蛋白条带进行成像. 相比于SDS-PAGE分析，WB检测时可将Cy5染色液稀释至10到20倍。染色液稀释是为了避免条带染色信号饱和。

不同染色方法的条件在表 1做出总结.

表1

染色液	优点	缺点	注意
胶体金	适用于NC及PVDF膜
考马斯亮蓝	便宜	在背景脱色过程中，蛋白会释放染料	可使用加热的染色液及脱色液缩短染色时间
	可重复使用	不同蛋白脱色速率不一致	可在脱色池放入组织吸附剂，有助于缩短脱色时间
		相对较窄的动态范围	使用50%三氯乙酸加入0.25%考马斯亮蓝，帮助提高检测灵敏度
		耗时
丽春红	快速, 易于保存	灵敏度低	可用水脱色推荐用于染色而不是免疫检测
墨汁	快速、便宜	缺少对比，很难成像分析	不可逆但不影响后续免疫检测
酰胺黑	快速, 易于保存	膜有变形可能性	不可逆不适宜后续免疫检测
Amersham	易于保存, 适用		高灵敏度
QuickStain	于NC膜及PVDF膜		总蛋白归一化，无需脱色处理