【Cytiva】WB样本制备之总蛋白浓度的测定

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Cytiva 28941279 28944045 80648356 28932235 28932248 28932317 28932361 80648470 80648451 80620958 80620426 80621034 11001341 80621186 11001342 80641877 80641896 80647957 RPN755E RPN756E RPN800E RPN810 RPN850E RPN851E 17044601 17061501 29030735 10600002 106

当比较在相同凝胶或凝胶之间的不同泳道上运行的样品的蛋白质量时，所有的泳道需加入相同的蛋白质总量。

如果相邻泳道之间的总蛋白存在显著差异，则目标蛋白表达的实际差异可以被掩盖，因此会被误导结果。

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通常使用几种分光光度法测定溶液中蛋白质的浓度（3）。这些包括蛋白质的固有紫外（UV）吸光度的测量以及基于蛋白质依赖性颜色变化的方法，例如经典的基于铜的洛里试验（4）、史密斯铜/双联喹啉测定（BCA）（5）和布拉德福德染料测定（6）。虽然广泛使用，但是这些实验步骤都不是非常的方便。

例如，紫外吸光度需要在没有干扰（UV吸收）物质的溶液中获得已知消光系数的纯蛋白质。在溶液中的蛋白质的近似浓度（假设使用具有1厘米的路径长度的试管）可以通过使用下列方程中的任一个来估计；

* A280代表蛋白质在280 nm处吸收的光，主要是环状氨基酸酪氨酸和色氨酸存在的结果。A205代表蛋白质在205 nm处吸收的光，主要是氨基酸之间肽键的结果。

† 蛋白质浓度 (mg/mL) = A280/1

‡ 蛋白质浓度 (mg/mL) A205/31

然而，不同的蛋白质在280和205nm处具有广泛不同的消光系数，并且以这种方式获得的浓度估计是粗略估计。

紫外吸光度要求蛋白质溶液不含其他紫外吸收物质，如核酸，并且使用石英试管进行测量。

铜/ BCA测定是基于通过酰胺还原Cu2+到Cu+的。虽然非常准确，但这些测定需要现配现用的试剂溶液，在测定过程中必须仔细测量和混合。紧随其后的是长时间、精确定时的孵育，在紧密控制的、升高的温度下，然后立即进行吸光度测量。这两种检测都可受到生化溶液中经常存在的其他物质的影响，包括洗涤剂、脂类、缓冲剂和还原剂 (3)。

因此，用铜/BCA测定，建议包括一系列标准溶液曲线，每个标准溶液具有不同的已知浓度的蛋白质，但与样品溶液具有相同的组成。

布拉德福德染料测定是基于三种形式的考马斯蓝G染料之间的平衡。在强酸性条件下，染料在其双质子化形式（红色）中最稳定。然而，当结合到蛋白质时，它在质子化形式（蓝色）中最稳定。

与上述其他测定相比，布拉德福德染料测定更快，涉及较少的混合步骤，不需要加热，并且给出更稳定的比色响应。然而，该测定容易受到非蛋白源，特别是洗涤剂的影响，并且在其有用的蛋白质浓度范围的高浓度区逐渐变得非线性。反应也随着蛋白质的结构而变化。这些限制使得有必要在本试验中使用蛋白质标准溶液有必要。

布拉德福德染料试剂主要与精氨酸残基反应，并在较小程度上与组氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基反应。因此，对碱性或酸性蛋白质的测定是不准确的，并且对牛血清白蛋白比“平均”蛋白质更敏感，大约是二分之一。IgG是BrdFAD染料测定的首选蛋白质标准。

总蛋白测定的产品

当用Western印迹法研究血浆或血清时，大量的血浆蛋白，如白蛋白和IgG可以掩盖蛋白质含量较低的信号。预填充柱如HITRAPμ白蛋白和IgG被设计为吸附这些潜在的有问题蛋白质的样品，分别去除95%白蛋白和＞90% IgG。

HITRAP白蛋白和IgG纯化1 mL柱设计为从约150μl未稀释的人血浆或血清样品中除去白蛋白和IgG，其含有正常的白蛋白水平（～40 mg/ml）和IgG（～15 mg/ml）。纯化过程需要大约35分钟，并且可以使用来自Sou-KTA平台、蠕动泵或手动与注射器的液相色谱系统来执行。当使用较小体积时，推荐白蛋白和IgG纯化SPInAPP，其设计可用于体积为50μL的人血浆或血清。

参考文献

1. Protein Sample Preparation: Principles and Methods, GE Healthcare, 28988741.

2. 2-D Electrophoresis: Principles and Methods, GE Healthcare, 80642960.

3. Stoscheck, C. Quantification of Protein. Methods in Enzymology Vol. 182 (Colowick,S. P. and Kaplan, N. O., eds.), Academic Press, New York (1990).

4. Lowry, O. et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265–275 (1951).

5. Smith, P. K. et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76–85 (1985).

6. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72,248–254 (1976).

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