【Cytiva】WB实验中印迹膜的选择

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Cytiva 28941279 28944045 80648356 28932235 28932248 28932317 28932361 80648470 80648451 80620958 80620426 80621034 11001341 80621186 11001342 80641877 80641896 80647957 RPN755E RPN756E RPN800E RPN810 RPN850E RPN851E 17044601 17061501 29030735 10600002 106

除了缓冲液pH、盐的类型、盐浓度以及是否加入SDS等洗涤剂等因素外，蛋白分子与膜的结合程度还会受到膜本身的物理和化学特性的影响，蛋白质的性质影响其与膜表面结合的能力。需要进行结合力测试，以便选择合适的转印膜。

膜通常是指孔径0.1-0.45μm的多孔材料，其结合能力主要取决于孔径大小。具有许多小孔的膜比具有较大孔的膜具有更大的结合表面，因此通常具有更高的结合能力。生物分子与膜相互作用的确切机制尚不清楚，目前普遍认为是非共价力和疏水力的组合。虽然蛋白质构象和缓冲液组成同样影响结合能力，但是Western印迹的灵敏度主要取决于固定在膜上并可以结合一抗的蛋白总量。然而，过量的蛋白结合不一定提高WB的信号强度，可能具有相反的效果。这是因为高浓度的蛋白通过弱相互作用力自我结合，此结合力强于蛋白与膜的结合力。这意味着蛋白质/抗体复合物在洗涤时很容易从膜上洗掉。

硝化纤维素和PVDF膜是用于Western blotting最常见的膜，有时也会用到尼龙膜。

硝化纤维素膜在多种应用中最常用到，其主要优点是背景低。生物分子与膜相互作用的确切机制尚不清楚，目前普遍认为是非共价力和疏水力的组合。在转印缓冲液中加入甲醇可改善蛋白质与硝化纤维素膜的结合。硝化纤维素膜不推荐用于多次stripping（洗脱）以及reprobing（二次孵育），因为膜会变脆，干燥时难以处理。Amersham Protran Supported等支撑材料加入进膜后，可提高NC膜机械强度。

PVDF膜具有较高的蛋白结合能力和机械强度，是蛋白免疫印迹需要stripping以及reprobing的极好选择。由于PVDF膜具有高度疏水性，因此在使用前需要将其在甲醇或乙醇中浸泡。蛋白质通过取向力和疏水作用结合到PVDF膜上。PVDF膜具有较高的蛋白结合能力，因此其背景值较高。

始终戴手套或用镊子处理膜，以避免手上的蛋白污染膜。用手接触膜造成的污染会影响目的蛋白条带信号。

表1 总结了硝化纤维素和PVDF膜的一些重要特性和优点。

表1 蛋白免疫印迹实验用膜的特性

膜	硝化纤维素膜	PVDF
结合方式	非共价力或疏水作用力	取向力和疏水作用力
最佳固定方式	高盐/低甲醇	预先浸泡在甲醇中
染色剂选择	Amido black Aniline blue black Ponceau S Colloidal gold Fast green Toluidine blue Amido black	India ink Silver Coomassie Brilliant Blue Ponceau S Colloidal gold
优点	通用性低背景	适用于小分子蛋白蛋白结合能力强机械强度高化学性质稳定
缺点	脆弱 – 无法用于抗体洗脱及再孵育

GE生产的硝酸纤维素膜

Amersham Protran 系列膜是高质量100%纯度硝化纤维合成产品。成卷以及切片的膜有三种孔径可选，特点是表面积大且均匀性好。Amersham Protran膜对于蛋白质印迹、斑点印迹和其他蛋白质或核酸检测具有良好的结合性能。

Amersham Protran硝化纤维素膜具有0.1、0.2和0.45μm的孔径，其包装尺寸包括卷、预切片和三明治。Amersham Protran硝酸纤维素膜是用于蛋白质印迹的结合基质，具有高亲和力、阻断能力和与多种检测方法(例如化学发光、显色、荧光)的兼容性等特点。

通常，小肽段的结合力随着膜孔径的减小而增加。因此，Amersham Protran 0.1和Amersham Protran 0.2都是处理小分子蛋白和多肽的良好选择。Amersham Protran 0.1膜具有0.1μm的最小孔径，对小肽(分子量<10kDa)和核酸(<300bp)具有极好的结合力，在化学发光Western印迹中背景极低。

Amersham Protran Premium系列膜（0.2和0.45μm孔径）保证了各种标记方法和检测技术(化学发光、荧光、比色和放射性)的高灵敏度、高分辨率和低背景。其中，低背景的特点提高了复杂样品的检测动态范围。

Amersham Protran Supported系列膜（0.2和0.45μm孔径）由硝基纤维素固定在惰性非织造支撑材料（聚酯）的两侧而组成。支撑材料不影响转印条件或结果，可使NC膜适用于二次孵育。无支撑材料的硝化纤维素在二次孵育过程中变得脆化，无法使用。

Amersham Protran膜适用于多种染色剂，例如Amido black, Aniline blue black, Ponceau S, Colloidal gold, Fast Green,以及Toluidine blue.

GE生产的PVDF膜

Amersham Hybond系列膜（0.2和0.45μm孔径）是硬度高且化学性质稳定的膜，是洗脱和二次孵育的极好选择。

小孔径的0.2μm膜避免了小分子蛋白穿膜并可与各种分子量的蛋白较好结合。这种膜与多种用于快速脱色的溶剂相容。Amersham Hybond应浸泡在100%甲醇或乙醇中，并在使用前浸泡在超纯水或转印缓冲液中。

Amersham Hybond 0.45具有低荧光特性，因此可用于多种荧光检测方法，如CyDye、IR染料和免染胶技术。

Amersham Hybond LFP系列膜（0.2μm孔径）是一种疏水的PVDF膜，适用于荧光Western检测应用，荧光背景低且灵敏度高。这种膜必须用甲醇活化，推荐使用Amersham ECL Plex™系列发光液进行检测。

Amersham Hybond SEQ系列膜（0.2μm孔径）适用于蛋白测序应用中。

多数情况下，可使用乙醇替代甲醇进行PVDF的浸泡。

膜选择指南

表2 Western blotting实验用膜

	材料	孔径 (μm)	物理强度	结合能力(μg/cm²)	最小蛋白尺寸 (Mr)
Amersham Protran	硝酸纤维	0.1	-	> 200	< 10000
_	_	0.2	_	> 150	< 20000
_	_	0.45	_	> 100	> 20000
Amersham Protran	硝酸纤维	0.2	-	> 170	< 20000
Premium	_	0.45	_	> 160	> 20000
Amersham Protran	带有支撑层	0.2	+	> 120	< 20000
Supported	硝酸纤维	0.45	_	> 100	> 20000
Amersham Hybond P 0.2	PVDF	0.2	+	> 300	< 20000
Amersham Hybond P 0.45	PVDF	0.45	+	> 200	> 20000
Amersham Hybond LFP 0.2	PVDF	0.2	+	> 200	< 20000
Amersham Hybond SEQ 0.2	PVDF	0.2	+	> 300	< 20000