【Cytiva】WB转印之蛋白转印

浏览量：132

Cytiva 28941279 28944045 80648356 28932235 28932248 28932317 28932361 80648470 80648451 80620958 80620426 80621034 11001341 80621186 11001342 80641877 80641896 80647957 RPN755E RPN756E RPN800E RPN810 RPN850E RPN851E 17044601 17061501 29030735 10600002 106

凝胶电泳后，其固体载体上固定和检测蛋白质的方法，起源于斯坦福大学George Stark的实验室。术语“Western blotting”专指蛋白质的转移并抗体检测蛋白质；此后，类似的用于检测DNA的方法被称为Southern blotting。相关技术方法不断扩充，包括Northern blotting（RNA）、Eastern blotting（翻译后修饰）、Far Western blotting（蛋白质-蛋白质相互作用）和Far Eastern blotting（脂质检测）。这里，我们仅关注蛋白质印迹（Western blotting）技术，并将介绍用于将蛋白质从凝胶转移到膜的不同方法。重点放在电转移上，因为这是目前Western印迹工作流程中最常用的方法。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）后，下一步是将蛋白质从凝胶转移到膜上，膜通常由化学惰性物质，如硝化纤维素（NC）或聚偏氟乙烯（PVDF）制成。转印后，特异性抗体可检测膜上的蛋白质，蛋白质在膜上的位置与电泳后蛋白条带的位置相同。

电转

鉴于电转印的速度、转印的均匀性和转印效率较好，目前电转是唯一的转印方式选项。电转印与PAGE胶电泳的蛋白质迁移原理相同。凝胶、膜和电极被组装在一个夹层中，使得蛋白质从凝胶转印到膜上（图1）。

图1 蛋白质由胶转到膜上. 胶与膜直接接触，蛋白在电场中由负极向正极移动.

胶膜三明治的整个区域应尽可能均匀地进行转印，以确保大、小分子量的蛋白质以相似的效率转移。使用梯度凝胶可以优化转移的均匀性，但是缺点是转移蛋白质将更加困难，因为它们更强地被“锁定”到聚丙烯酰胺基质中。这是蛋白质定量分析的一个特别重要的考虑因素。

电转印是快速、高效，且简单易用的。转印时间和转印电流进行优化后，即可制定标准化的转印条件。两种类型的电转印：湿转和半干转，是目前实验室常用的转印方式。GE医疗既提供高性能湿转印迹设备，也提供半干式印迹设备。

半干转印仪器需要低电压和极少的缓冲液，不需要冷却（表1）。

表1 GE的湿转及半干转印设备

miniVE垂直电泳系统：电泳及电转印一体机，由四部分组成：灌胶/跑胶模块；转印模块（选配）；省缓冲液的水槽及保护盖；可以同时使用两个凝胶模块或两个转印模块。

TE 22 Mini式水槽转印装置：四块mini胶同时转印，仅需1L转印缓冲液，设备包含一个磁力搅拌器，使缓冲液循环以保证转印过程中温度均匀。与MultiTemp™恒温循环水浴联通后，可对转印槽进行冷却降温。

TE 62转印装置：适用于各类印迹膜的大尺寸湿转设备，可同时转印4块15×21cm胶或16块7×10cm的mini胶。

TE 70/TE 70 PWR and TE 77/TE 77 PWR半干转印设备：适用于弱电流、电压及使用少量缓冲液的电转印实验，TE 70 PWR/TE 77 PWR单元具有内置电源，及新颖的自动停止功能；当缓冲液耗尽时，转印自动停止，避免过热。

TE 70适用于14×16厘米的凝胶，而TE 77则适用于21×26厘米或四个并排放置的mini胶。不到1小时即可完成转移。

1、湿转

湿转实验中，凝胶和膜都完全浸没在转印缓冲液中，并且电流的方向是由胶到膜。通常，湿转需要冷却单元并通过磁力搅拌棒对转移缓冲液进行内部循环。对于大分子量蛋白，建议采用湿转，但是转印速度较慢并需要大量的缓冲液。为了得到清晰、尖锐的条带，获取高质量的转印效果，优先选择湿转，次选半干法转印。在湿转过程中，大量缓冲液会升温，温度升高会导致蛋白质不可逆地变性。因此，使用冷却缓冲液并保持低温非常重要，许多商品化湿传系统可连接到恒温循环水浴。另一个常见的过程是在4°C环境下进行整个湿转实验，比如在冰箱中。

图2 湿转装置

图2 湿转系统。转移夹层的组装最好在装有转印缓冲液的槽中进行，缓冲液水位至少为3厘米。组装三明治时，首先在阳极（+）一侧放入海绵，接着放入两张湿润的滤纸、选好的膜、凝胶，另外两张湿润的滤纸，最后是第二块海绵。注意避免三明治的不同层之间的褶皱或气泡。然后将三明治牢固地固定在转印卡槽中，并浸没在包含转印缓冲液的转印槽中。该结构必须使膜位于凝胶的阳极（+）侧。

2、半干式转印

半干法转印比湿转快，且消耗较少的缓冲液。膜与胶直接接触，并在凝胶和膜的上方和下方各放几层缓冲液润湿的滤纸。三明治由滤纸：凝胶：膜：滤纸组成，放置在电场中。半干转印通常比湿转效率低，特别是对于大分子量蛋白（图3）。当电极板吸附热量时，产热对于半干转印的影响较小，但应避免延长半干转印时间，因为这可能导致由于缓冲液耗尽而造成的过热和凝胶干燥。

滤纸和膜应剪成比凝胶的长和宽小几毫米。确保滤纸和膜不与凝胶重叠，避免系统短路，或导致蛋白质的低效或不均匀转移。

●将一块开口尺寸与凝胶完全相同的塑料板，与三明治配合使用（三明治放入塑料板中空区域），可有效避免样品无法通电问题。