【Cytiva】Western blotting 技术问题解答
Western blotting 转印中的问题
问题1：转印后膜上蛋白少或没有 | |
可能原因 | 解决方案 |
凝胶与膜接触不好 | 确保转印时滤纸、凝胶、膜摆放位置正确并接触紧密，无气泡。 转印后，凝胶可以用 Ponceau 染色或者预染 marker 检查转印效率。 转印中使用较厚的 3MM, 17CHR 或 GB 系列转印滤纸。 |
转印装置正负极摆放不对 | 确保膜处在阳极位置，凝胶在阴极。 确保转印正负电极连接位置正确。 |
目的蛋白被其他高丰度蛋白掩盖，如白蛋白，IgG等。 | 去除高丰度蛋白 |
问题2：膜上蛋白条带出现拖尾 | |
可能原因 | 解决方案 |
转印过程过热 | 对于湿转： 确保转印槽中 buffer 没过转印模块。 Buffer 可先预冷或者在低温环境下转印。 降低转印电流电压，延长转印时间。 对于半干转： 降低转印电流，不要超过 0.8 mA/cm2。 增加转印滤纸数量。 |
蛋白样品过量或者有杂质干扰，如脂类、核酸、IgG、白蛋白等 | 使用GE相应的样品分级及除杂试剂盒，去除杂质。 |
问题3：分子量小的蛋白转印效率低 | |
可能原因 | 解决方案 |
小蛋白在膜上结合量少 | 使用蛋白结合能力更强的膜。 增大 SDS-PAGE 凝胶浓度。 使用小孔径印迹膜，如 0.1um 或 0.2um Protran 印迹膜。 |
转印 buffer 中残留的 SDS 影响蛋白与膜的结合 | 转印 buffer 中不要有 SDS。 转印前凝胶与转印 buffer 平衡至少 15min 以上。 |
转印 buffer 中甲醇浓度太低 | 提高甲醇的浓度（15%-20%） |
蛋白结合时间不够 | 调低电压，延长转印时间。 |
问题4：分子量大的蛋白转印效率低 | |
可能原因 | 解决方案 |
甲醇浓度太高 | 降低甲醇浓度至 10%（V/V）以下。 |
蛋白结合时间不够 | 使用湿转代替干转。 延长转印时间。 |
蛋白凝胶浓度太高 | 降低凝胶浓度 转印 buffer 中添加 0.1%SDS，促进蛋白溶解。 （注意：SDS 可以促进蛋白的溶解，但是也会破坏蛋白与膜的结合） |
问题5：半干转印时效率低 | |
可能原因 | 解决方案 |
电流未经过 “ 三明治 ”印迹膜 / 滤纸组合 | 确保滤纸、凝胶和膜的尺寸大小一致。 PVDF 膜预先用甲醇浸泡，转印三明治先用转印 buffer 充分浸湿。 |
问题6：转印后膜上蛋白不平整 | |
可能原因 | 解决方案 |
气泡的影响 | 转印前确保膜充分浸湿。 使用玻璃棒赶除气泡。 |
指纹污染 | 操作时戴手套，避免手指与膜直接接触。 |
膜变干 | 避免膜变干。 |
Western blotting 标记与检测中的问题
问题1：信号弱 | |
可能原因 | 解决方案 |
封闭试剂不合适（封闭试剂可与目的蛋白相结合） | 更换不同的封闭试剂，或者降低封闭试剂浓度。使用 Biotin/Streptavidin 检测系统时，不要使用牛奶作为封闭试剂。 降低封闭试剂中去污剂的浓度，通常 0.05%-0.1% Tween-20 或 SDS 足够去除膜的高背景（可以尝试使用 TritonX-100 代替 Tween-20）。 对与单抗或者高度纯化的抗体，封闭试剂中不含去污剂效果会更好。优化洗涤的次数降低信噪比。 如果检测磷酸化的蛋白，避免使用含有磷酸的缓冲液（如 PBS）。 |
过度封闭 | 室温封闭不超过 1hr 或者低温 4 度过夜。 |
曝光时间过短 | 延长曝光时间。 |
抗体结合时间不够或者温度不合适 | 一抗或二抗在室温通常结合 1-2 小时，如需要长时间抗体反应，可以在 4 度下反应 12-16 小时。 |
一抗选择不合适 | 确保一抗能够识别目的蛋白，可通过 dot-blot 检验。 |
抗体浓度太低 | 优化抗体浓度。 |
二抗被NaN3 保护剂抑制 | 如果二抗是 HRP 标记的，确保二抗中不含有 NaN3 保护剂。 |
蛋白的上样量太少 | 增大上样量。 |
抗体或者检测试剂过期 | 检查 Western blotting 相关试剂有效期。 |
问题2：没有信号/空白带 | |
可能原因 | 解决方案 |
抗体浓度太低 | 优化抗体的使用浓度。 |
二抗种属问题 | 确保二抗能够识别所用的一抗。 |
使用的一抗是天然蛋白免疫制备的 | 天然蛋白免疫制备的抗体可能不能识别变性的蛋白，检查抗体 |
检测试剂过期 | 确保检测试剂的有效期，设置阳性对照。 |
信号太强，底物被消耗 | 降低抗体浓度或者蛋白上样量。 |
问题3：高背景 | |
可能原因 | 解决方案 |
印迹膜选型不合适或有蛋白污染 | 提高封闭试剂浓度或延长封闭时间。 换用更低背景的 Protran Premium(PTP) 印迹膜。 |
封闭不足 | 更换封闭试剂，并确保封闭试剂充分溶解。提高封闭试剂浓度和延长封闭时间。 |
洗涤不够 | 增加洗涤次数，延长洗涤时间。洗涤缓冲液中添加 0.1%(V/V) 的 Tween-20。 ( 可以在洗涤缓冲液中添加 0.5MNaCl 或者 0.2% SDS 有利与降低背景 )。 |
二抗浓度太高 | 优化抗体浓度 |
封闭试剂与抗体交叉反应， 需更换封闭试剂。 | 比如检测磷酸蛋白，建议使用 BSA 代替牛奶作为封闭试剂，因为牛奶中含有磷酸化的蛋白。 |
一抗，二抗浓度太高 | 优化抗体浓度。 |
上样量太大 | 降低上样量。 |
问题4：非特异 | |
可能原因 | 解决方案 |
非特异的小蛋白带 | 可能是目的蛋白降解产生的。请参考 GE 样品制备指南，建议样品制备时冰上快速操作，添加蛋白酶抑制剂等。 选择与小蛋白带没有交叉反应的抗体。 目的蛋白可能有多种亚型或者具有不同的亚基组成。 |
非特异的大蛋白带 | 可能是目的蛋白的不同修饰造成的。 |
一抗的特异性不好 | 使用更严格的洗涤条件。 |
荧光 Western blotting 相关问题
问题1：高背景 | |
可能原因 | 解决方案 |
膜上的荧光背景太强 | 换用低荧光背景的 ProtranPremium 或 LFP 印迹膜。 跑胶时，确保溴酚蓝已经跑出凝胶，溴酚蓝会干扰荧光信号。 当使用 Cy3 标记的二抗时，使用 Tween-20 作为 detergent，TritonX-100 会干扰 Cy3 的荧光信号。 建议使用 GE 专用膜记号笔，避免污染。 |
问题2：多通道问题 | |
可能原因 | 解决方案 |
与实验设计相关 | 确保二抗能有效地分开不同种属的一抗。 |
问题3：斑点背景 | |
可能原因 | 解决方案 |
膜上有灰尘污染 / 圆珠笔做记号 | 避免手指与膜接触。 使用 70% 乙醇擦拭扫描仪，保证成像相关物品干净。 避免使用圆珠笔在膜上做记号。 |
问题4：低信号 | |
可能原因 | 解决方案 |
漂白 | 荧光基团标记的抗体需要避光，避免光漂白。 |
激发光及滤光片选择不对 | 正确使用激发光及滤光片。 |
成像仪的设置不对 | 选择合适的曝光时间和检测器的强度。 |
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