胶原酶类相关产品介绍
Clostridium histolyticum含有两个不同但相关的胶原酶基因。col G基因编码一个936个氨基酸的蛋白质，被指定为胶原酶I型；col H基因编码一个1021个氨基酸的蛋白质，被指定为胶原酶II型。部分纯化的胶原酶制剂中含有这两个基因产物的几个同工酶，一个巯基蛋白酶，clostripain，一个类胰蛋白酶的酶，和一个氨基肽酶。这种胶原酶和蛋白酶活性的组合有效地分解细胞间基质，这是组织解离的关键部分。这个复合物的一个组成部分是一种水解酶，优先降解原生胶原中的螺旋区域，特别是在序列Pro-Y-Gly-Pro中的Y-Gly键，其中Y最常见是一个中性氨基酸。这种切割产生易受进一步肽酶消化的产物。在蛋白酶中，只有胶原酶能够降解常见于皮肤、肌腱、血管和骨骼等结缔组织的三螺旋天然胶原纤维。胶原酶相对温和，在生理温度和 pH 值下解离良好，无需机械搅拌或特殊设备，适用于人类肿瘤、小鼠肾脏、成人和胎儿大脑以及许多其他组织（包括上皮细胞）的培养。
部分纯化的胶原酶受到螯合金属剂（如半胱氨酸、EDTA或o-菲啰啉）的抑制，但不受DFP的抑制。它还受到A2-巨球蛋白，一种大型血浆糖蛋白的抑制。Ca2+是酶活性所需的。
●每种胶原酶的特定酶学特征已经与用于研究的细胞来源的组织（或细胞用途）相关联。根据这些关联，Worthington已经建立了几种部分纯化的胶原酶：类型1、2、3、4、5、6和7。
●Life Technologies的一组胶原酶产品是从肠溶性梭菌中提纯的。它们用于细胞和组织的解聚。用于组织解离的胶原酶通常是一种粗制制剂，其中含有梭菌三肽酶A和许多其他蛋白酶、多糖酶和脂肪酶。这种粗制制剂非常适合组织解离，因为它包含了攻击原生胶原和网状纤维所需的酶，以及水解结缔组织和上皮组织的细胞外基质中的其他蛋白质、多糖和脂质的酶。粗制胶原酶会出现批次间的变异性，并且可能会产生偶发毒性。这些粗制胶原酶制剂的活性与它们在解离特定组织类型方面的有效性相关联，Gibco™将粗制胶原酶制剂按类型分为I 型、II 型、IV 型，已发现这些选定的类型在从各种组织中制备细胞时表现更好。
Gibco胶原酶使用方法
Product | Catalog No. | Amount | Storage |
Collagenase: TypeⅠ | 17100017 | 1g | 2℃ to 8℃ |
Collagenase: TypeⅡ | 17101015 | 1g | 2℃ to 8℃ |
Collagenase: Type Ⅳ | 17104019 | 1g | 2℃ to 8℃ |
Collagenase, lyophilized | 17018029 | 500mg | 2℃ to 8℃ |
1
17100017
胶原酶，I型 ，粉末
2
17101015
Ⅱ型胶原酶，粉末
3
17104019
Ⅳ胶原酶，粉末
使用步骤：
① 将含有钙和镁的1 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS）直接加入1克胶原酶瓶中。轻轻振荡以确保完全溶解。
② 转移至一个干净的管中。
③ 确定所需的含有钙和镁的HBSS体积，使胶原酶溶液达到100 U/μL（1000倍浓缩溶液）。用这个体积的含有钙和镁的HBSS冲洗瓶子，并混合。
④ 用低蛋白结合过滤器过滤掉1000倍浓缩溶液。立即使用或进行第5步。
⑤ 分装成小份并在-20°C至-5°C的环境中避光储存。
⑥ 使用前在冰上解冻。避免多次冻结/解冻循环。建议将再生胶原酶浓度控制在50-200 U/mL（或0.1-0.5% W/V）。
组织解离步骤
① 使用无菌手术刀或剪刀将组织切成3-4毫米大小的碎片。
② 用含有钙和镁的HBSS多次清洗组织碎片。
③ 添加足够的含有钙和镁的HBSS以浸没组织。将再生胶原酶添加到50-200 U/mL。
④ 在37°C下孵育4-18小时。使用摇床平台并在消化中补充3毫米CaCl2可提高效率。
⑤ 通过经过无菌不锈钢或尼龙网格来分散细胞。剩余的组织碎片可以通过加入新的再生胶原酶溶液并在37°C下进一步孵育来分散。
⑥ 通过在不含胶原酶的HBSS中离心多次清洗分散的细胞。
⑦ 在最后一次洗涤步骤后，将细胞沉淀悬浮在培养基中。使用Countess®自动细胞计数器确定活细胞密度（也可以使用其他自动或手动方法）。
⑧将细胞播种到含有适当培养基的培养容器中。
器官灌流步骤
① 将胶原酶添加到预热（37°C）的含有钙和镁的HBSS中。添加3mM CaCl2可提高解离效率。
② 以特定器官的预优化速率对器官进行灌流。
③ 通过将灌流液通过无菌不锈钢或尼龙网格来将分散的细胞和组织碎片与较大碎片分离。剩余的组织碎片可以通过加入新的再生胶原酶溶液并在37°C下进一步孵育来分散。
④ 通过在不含再生胶原酶的HBSS中离心多次清洗分散的细胞。
⑤ 在最后一次洗涤步骤后，将细胞沉淀悬浮在培养基中。使用Countess®自动细胞计数器确定活细胞密度（也可以使用其他自动或手动方法）。
⑥将细胞播种到含有适当培养基的培养容器中。
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