【Promega】用于生物治疗药物研发的 Lumit™ Fc Receptor Binding Assays

治疗性抗体的有效性不仅取决于 Fab 片段与靶抗原的结合活性，还取决于 Fc片段与 Fc 受体之间的结合活性。例如，Fc片段与新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力对抗体的半衰期具有一定影响，而其与Fc 受体(FcVR)的结合亲和力则会影响抗体诱导细胞效应子功能的能力，例如 ADCC(抗体依赖性细胞毒性)和 ADCP(抗体依赖性细胞吞噬作用)。因此，在药物研发过程中必须针对一组 Fc 受体对候选治疗性抗体进行相应检测。

lgG 结合Fc 受体(FcR、FcRn)的图示。不同lgG 亚类的结合亲和力也有所不同。ITAM=免疫受体酪氨酸活化基序;ITIM=免疫受体酪氨酸抑制基序;y2=FcRy亚基二聚体;B,m=B-2 巨球蛋白。

参考自:

Bruhns, P.(2012) Blood 14;119(24):5640-9;

Smith, KGC.(2010) Nat Rev lmmunol May;10(5):328-43;

Hogarth, PM.(2012) Nat Rev Drug Discov Mar 30;11(4):311-31.

新生儿 Fc 受体(FcRn)是一种多功能非典型 Fcγ受体，其在全身多种组织中(包括上皮细胞、内皮细胞和造血源性细胞)进行表达。在 pH 呈酸性时，FcRn在核内体中与lgG 抗体的Fc区域发生结合。FcRn的功能包括通过极化细胞屏障(如上皮细胞)转运 lgG 同时保护 lgG 免于降解，从而调节抗体在血清中的半衰期。由于半衰期延长有助于患者取得更好的治疗疗效以及降低给药频率，因此 FcRn 与治疗性 lgG 相互作用的研究是药物研发过程中需进行优化的关键参数。

Fcγ 受体(FcVR)通过与lgG的 Fc 结合从而介导多种生物反应，包括抗体依赖性细胞毒性、内吞作用、吞噬作用、释放炎症介质和增强抗原呈递等。在人体中，研究人员已在多种细胞类型中对下述三组 FcvR 进行了研究及描述:FcγRI(CD64)FcyRIIa/b/c(CD32a/b/c)和 FcγRIIIb(CD16a/b)。这些类型的 FcvR在多种免疫细胞表面以不同组合进行表达。研究人员将 FcγRI分类为高亲和力受体(nM K_D)，而将 FcyRII和FcγRIII 分类为低亲和力至中等亲和力受体(μM K_D)。多项研究表明,不同的 Fc 受体基因型对 Fc 介导的效应具有显著影响。例如，与变体 F158 相比，决定 NK 细胞 ADCC 活性的 FcγRIIIa 显示多态性变体 V158 对 lgG1的结合活性更高。

抗体依赖性细胞毒性(ADCC)由 NK细胞介导，NK 细胞通过 FCγR结合 lgG的 Fc 区而被激活。刺激细胞毒性效应功能可导致靶细胞死亡。

抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)由巨噬细胞 FCγR 与 lgG 的 Fc 区发生相互作用而诱导，进而增强其吞噬活性。

胞饮作用后，核内体内的酸性条件可促进 FcRn lgG 的相互作用。未结合的lgG部分与其他蛋白一起在溶酶体中发生降解，而 FcRn 结合的lgG 则通过胞吐作用保留并进行释放。

Lumit™ FcγR  Binding lmmunoassays 是一种新型均相、无需进行洗涤步骤的竞争检测系统，其用于测定人Fc受体与抗体或 Fc融合蛋白之间的相互作用。更为重要的是，该检测系统可对溶液进行检测，进而避免了固定液导致的实验假象。这些检测系统主要用于治疗性抗体的研发，可对抗体进行优化并对抗体效价进行检测。

FcγR检测系统包括 LgBiT 标记的人 lgG₁(示踪剂 Ab-LgBiT)和与 SmBiT 标记链霉亲和素结合的生物素化人FcγR(胞外结构域)(hFcγR-生物素-链霉亲和素-SmBiT)。在不存在分析物抗体(分析物 Ab)的情况下，示踪剂与标记的 hFcγR 结合可产生最大发光信号。由于与示踪物竞争，发光信号呈浓度依赖性降低，表明分析物抗体结合较为明显。这些易于使用的生化检测系统可用于补充和提供相关正交数据，以支持基于细胞的功能性生物活性检测的结果。

检测原理

检测特征

Lumit™ FcγRⅠ Binding lmmunoassay

Lumit™ FcγRl Binding lmmunoassays 是对效价进行检测的系统，其可用作基于细胞的功能性Fc效应活性检测的补充系统。FcγRI以亚类特异性方式与lgG发生结合，IC值反映了与 lgG 的相对亲和力(lgG₃>lgG₁>lgG₄>>>lgG₂）。

Lumitm FcγRIIIa (F158)Binding lmmunoassay

Lumit™ FcγR Binding lmmunoassays 用于对抗体聚糖状态进行评估。检测到非岩藻糖基化(抗 hCD20-hlgG1fut)或非糖基化(抗 hCD20-hIgG1NQ)抗体的 IC₅₀偏移。

Lumit™ FcγRl Binding lmmunoassay

Lumit™ FcγRlla (H131) Binding lmmunoassay

Lumit™ FcγRlla (R131) Binding Immunoassay

Lumit™ FcγRllla (V158) Binding lmmunoassay

Lumit™ FcγRllla (F158) Binding lmmunoassay

Lumit™ FcRn Binding lmmunoassay是一种均相、无需进行洗涤的竞争检测系统，其用于测定人新生儿FcRn与Fc 蛋白(包括抗体)之间的相互作用。更为重要的是，该检测系统可对溶液进行检测，进而避免了固定液导致的实验假象。该检测系统可用于治疗性抗体的研发，以评估并调整因优化抗体与 FcRn发生结合后而产生的抗体半衰期。此外，该检测系统还用于测定抗体氧化状态和检测抗 FcRn 阻断抗体。

该检测系统包括LgBiT 标记的人 lgG1(示踪剂 Ab-LgBiT)和与 SmBiT 标记链霉亲和素结合的生物素化人 FcRn(胞外结构域)(hEcRn-生物素-链霉亲和素-SmBiT)。在不存在分析物抗体(分析物 Ab)的情况下，示踪剂与标记的 hFcRn 结合可产生最大发光信号。由于与示踪物竞争，发光信号呈浓度依赖性降低，表明分析物抗体结合较为明显，

检测原理

检测特征

Nath, N.et al.(2021)Deciphering the interaction between neonatal Fc receptor and antibodies using a homogeneous bioluminescent immunoassay. J lmmunol. 207(4)，1211-1221.

Tian, Z.et al. (2021).Harnessing the power ofanti-bodies to fight bone metastasis. Sci Adv. 7(26),eabf2051

FcRn与一组治疗性抗体的结合

使用 Lumit™ FcRn Binding lmmunoassay 检测了一组治疗性抗体与 FcRn 的亲和力。研究人员观察到lgG/FcRn 结合的检测窗口极佳。

抗体 -FcRn 亲和力的氧化性损失

将治疗性抗体与 0.3%H₂O₂共同孵育 1~24 小时，从而诱导甲硫氨酸氧化。结果显示，使用Lumit™ FcRn Binding Immunoassay可轻松检测到抗体-FcRn亲和力的剂量依赖性因发生氧化而造成的损失。

Lumit™ FcRn Binding lmmunoassay

Cat.# W1151,W1152