【Polysciences】线性 PEI 转染试剂 MW25,000（23966）

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polysciences PEI25000-1G 23966

线性 PEI 转染试剂 MW25,000

货号	产品名称	规格
PEI25000-1G	PEI MW25,000 线性	1G

基本信息

CAS	9002 - 98 - 6, 26913 - 06 - 4
分子式	(CH2CH2NH)n
分子量	25,000
熔点	73 - 75℃
溶解性	溶于热水，低 pH 值的冷水，甲醇和乙醇；不溶于苯、乙醚、丙酮
形式	白色固体
安全防护	手套及口罩
保存	4 度避光干燥保存，配置好的工作液 4 度避光保存
运输	常温

PEI 工作液配置 (1 mg/mL)

1、1g PEI25,000 溶解于 900ml 去离子水中,加热(60-80 ℃)并搅拌加入 HCL(12 M)调整PH值至 2-3,继续搅拌直至粉末完全溶解。(至少 3 小时以上，最好过夜)。

2、用 NaOH(10M)调整 pH 至 6.9-7.1。

3、将溶液转入量筒（或量杯）定容至 1L。

4、用(0.2um)滤器真空过滤消毒, 分装保存在 4°C 至少稳定保存 3 个月。

注意

●加热或加酸都有助于PEI 溶解。当然酸可能不用加那么多，详细用量可试加一点搅拌看看，足够溶解就行，不一定需要加到 pH 那么低。

●一定要溶解充分，溶解不充分会影响后续的转染效率。

操作方法

●特别提醒：初次使用 PEI 进行不同基因转染时应先做预试，优化出适合自己实验的最佳 PEI 和 DNA 的比例。

一、贴壁细胞转染

以 6 孔板转染 293T 细胞为例，大规模细胞转染可参考文献；

（一）转染前准备

1) 转染前一天：用胶原酶（WORTHINGTONG 公司 LS004196)消化细胞并计数（不建议用胰酶）。按照每孔2×10 6的细胞量接种293T 至 6 孔板(每孔加入 2ml 新鲜的 DMEM:F12+5%FBS 完全培养基和 1ml 的细胞悬液)置于 37°C,5%CO₂培养箱培养 24h。

2) 24h 后,移除之前培养基，每孔加入 2ml 新鲜的转染 DMEM:F12+5%FBS。注意：确保 293T 细胞生长状态良好传代不超过 15 代。

（二）转染过程

3) 第一天：显微镜下检查细胞汇合度，当细胞至少达到 70%到 80%的汇合度时，开始准备转染。

4) 对于每孔细胞，用 100µl 无血清培养基（如 OPTI-MEMⅠ培养基）稀释 DNA，使 DNA 终浓度为 1ug/ml（DNA/总培养体积）。

5) 对于每孔细胞，用 100μL 无血清培养基（如 OPTI-MEMⅠ培养基）稀释适当比例的适量 PEI25000。DNA:PEI 的比例要依据自己实验摸索最适比例。

6) 将稀释的 PEI25000PE 转染试剂加入到稀释的质粒中（总体积 200µL）轻轻混匀，室温孵育 30 分钟。

7) 小心地将 PEI-DNA 复合物滴加到细胞培养板每个孔中，轻轻摇动培养板混匀。注意加入混合液时轻轻沿着孔板边缘滴入，而不是在细胞的顶部以免破坏细胞的粘附性。

8) 将培养板放入 37°C,5%CO2培养箱培养中培养 24h。

（三）观察转染结果

9)第二天：在荧光显微镜下观察细胞转染效率，通常超过 80%的 293T 细胞在转染后的 24h可以观察到绿色荧光。

小贴士

●建议进行不同基因转染时应对 PEI 和 DNA 的比例进行优化，以达到最适比例，通常筛选范围在 1:1 到 5:1 之间。

●通常情况下，分别准备 PEI 和 DNA 转染溶液时其体积一般是转染前每孔细胞培养液体积总量的 1/10-1/20 ，如细胞培养液体积为 3ml，则稀释 PEI 及 DNA 的体积为150ul。质粒 DNA 的浓度通常为 1ug/ml（DNA 质量/细胞培养总体积）

●不同质粒种类以及大小会影响转染效率，如较大片段插入质粒可能转染效率低，可根据实际实验需要调整，如适当增加转染质粒总量等。

●HEK293GnTI 细胞重悬浮可用枪头或移液管反复吹打，但 CHO-S 细胞的粘附性比较强重悬浮时需要借助细胞刮刀。

●一般建议用胶原酶消化细胞，如果表达的是膜蛋白，胰酶消化细胞可能会降低蛋白表达，建议用胶原酶消化细胞，我们推荐用(LS004196，WORTHINGTONG)的胶原酶。

●对于贴壁性低的细胞系，可用明胶或鼠尾胶铺板，增加细胞与培养皿之间的粘附性。

●一旦确定了细胞类型、培养基和 PEI 与 DNA 的最佳比例，就可以在转染后 24 至96 小时内多次观察转染效率，以优化最大表达量时间点。

二、悬浮细胞转染

离心对数期生长的细胞用新鲜的培养基重悬浮使细胞密度达到 1×10⁶cells/mL 小规模转染时，如需大规模转染细胞密度要到达 2-3×10⁶cellsml/mL，可参考文献。以 293F 细胞于 100mL 培养瓶（溶液体积占瓶体积的 1/5）操作体系举例如下：

（一）转染前准备

1) HEK293F 细胞传代接种于 20mL 悬浮细胞生长培养基中(36.5℃，120rpm，5%CO₂)的条件下培养。当细胞密度到 1X10⁶cells/mL，然后旋紧瓶口放入摇床继续培养，2~4 小时后可以进行转染。

（二）转染过程

2)用 1mlOptiPRO™SFM(无血清培养基)稀释适量的 DNA，使 DNA 终浓度为 1ug/ml（DNA/总培养体积）。混匀并静置 5min。

3)用 1mlOptiPRO™SFM(无血清培养基)稀释适当比例的 PEI25000，混匀并静置 10min。

（PEI：DNA 参考比例范围，可参考上述贴壁细胞 PEI 和 DNA 优化方案优化）。

4) 将稀释的 PEI25000 转染试剂加入到稀释的质粒中轻轻混匀，室温孵育 30 分钟。

5)将 PEI-DNA 转染复合物逐滴加入到细胞培养液中，摇匀后旋紧瓶口放回摇床（36.5℃，5%CO₂，120rpm）。

6)基因表达可在 24-72 小时后检测，具体时间取决于细胞系和转基因。

小贴士

在悬浮培养中，单个细胞的转染效率要高于聚集在一起的细胞，需要优化适合单细胞的生长条件。

●方形瓶应经过两个连续的干燥循环高压灭菌（每个 45 分钟，干燥 15 分钟）

●盖子应尽可能松，不得脱落。应该让它们冷却拧紧盖子前，将其完全放入层流罩中。如果瓶子向内塌陷，细胞将无法正常生长。

●如果要获得更多的蛋白产量，有参考文献表明转染后 24 小时，可以适当稀释细胞，稀释比例参考范围（1:2—1:5）之间，可以增加蛋白产量，稀释效应与最佳稀释比率应根据经验确定。

●可以把 DNA 和 PEI 转染试剂直接加入到细胞悬液中进行转染，但必须经过上述特定流程的 DNA 和转染试剂的比例和用量的相应优化。

●请根据自己实验用的细胞类型检索文献调整最佳细胞接种密度和适合的培养基及优化最佳的转染条件。

背景

PEI 是一种优化的线性阳离子聚合物转染试剂分子量分别为 25000 和40000。PEI40000 相比 25000 转染效率高，但毒性也略大于 PIE25000。在 HEK293和 CHO 的蛋白表达系统中，

相比于市面上的脂质体 PEI 都表现出高的蛋白表达量（无论是 96 孔板还是 100L 的细胞反应器），以及更小的细胞毒性、更高的转染效和更高的可重复性，并且十分经济的高性价比转染试剂。产品具有以下特点：

●转染效率高，细胞毒性低；

●蛋白表达量高；

●节约成本：PEI 至少能够降 40% 的转染试剂总成本；

●适用于 HEK293 等真核细胞的转染；

●适用于贴壁细胞和悬浮细胞的转染；

●适用于有血清和无血清的转染条件；

●无机试剂，无动物源成分；

●产品稳定，质控严格；

●工艺流程适用范围广，容易优化适合小规模培养板，培养瓶到大规模的生物反应器。

表 1 可借鉴的转染参数（96-孔板- 5L 生物反应袋）

常见问题

注意

本手册仅为 PEI 基本操作说明指导。基于 PEI 的转染效率受多种因素影响，包括PEI/DNA 复合物的制备方式、PEI 与 DNA 的比例、DNA 浓度、PEI 溶液的储存条件等。本手册不能覆盖 PEI 转染涉及的所有问题，只能根据主要影响因素，如 PEI/DNA 比例 PEI 和 DNA 的浓度，孵育时间等提供相应的操作指南，以提高其效率、重复性和一致性。如果我们提供的 PEI 手册无法回答您的问题，请根据自己实验用的细胞类型检索文献调整最佳细胞接种密度和适合的培养基等，为自己的实验找到合适的转染方法。

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