【Polysciences】PEI 转染试剂MW40,000使用说明（24765-1）

1、称取 1g 24765-1溶于 900ml 去离子水中。

2、搅拌直至完全溶解。

3、加入 NaOH(1N)调整 PH 至 6.9-7.1。

4、如果 PH 超过 7.10，加入 HCL(1N)调整 pH 至 6.9-7.1。

5、将溶液转移至量杯或者量筒定容至 1L 。

6、用(0.2um)滤器真空过滤消毒,4°C 至少稳定保存 3 个月。

注意

●一定要溶解充分，溶解不充分会影响后续的转染效率。

●特别提醒：初次使用 PEI 进行不同基因转染时应先做预试，优化出适合自己实验的最佳 PEI 和 DNA 的比例。

一、贴壁细胞转染

以 6 孔板转染 293T 细胞为例，大规模细胞转染可参考文献。

（一）转染前准备

1) 转染前一天：用胶原酶 （WORTHINGTONG 公司 LS004196)消 化细胞并计数（不建议用胰酶）。按照每孔2×10 6的细胞量接种293T 至 6 孔板(每孔加入 2ml 新鲜的 DMEM:F12+5%FBS 完全培养基和 1ml 的细胞悬液)置于 37°C,5%CO2培养 箱培养 24h。

2) 24h 后,移除之前培养基，每孔加入 2ml 新鲜的 DMEM:F12+5%FBS。注意：确保 293T 细胞生长状态良好传代 不超过 15 代。

（二）转染过程

3) 第一天：显微镜下检查细胞汇合度， 当细胞达到 70%到 80%的汇合度时，开始准备转染。

4) 对于每孔细胞，用 100µl 无血清培养基（如 OPTI-MEMⅠ培养基）稀释 DNA 使 DNA 终浓 度为 1ug/ml（DNA/总培养体积）。

5) 对于每孔细胞，用 100μL 无血清培养基（如 OPTI-MEMⅠ培养基）稀释适当比例的适量 24765-1。DNA:PEI 的比例要依据自己实验摸索最适比例。

6) 将稀释的 24765-1转染试剂加入到稀释的质粒中（总体积 200µL）轻轻混匀， 室温孵育 30 分钟。

7) 小心地将 PEI-DNA 复合物滴加到细胞培养板每个孔中，轻轻摇动培养板混匀。注意加 入混合液时轻轻沿着孔板边缘滴入，而不是在细胞的顶部以免破坏细胞的粘附性。

8) 将培养板放入 37°C，5%CO2培养箱培养中培养 24h。

（三）观察转染结果

9)第二天：在荧光显微镜下观察细胞转染效率，通常超过 80%的 293T 细胞在转染后的 24h可以观察到绿色荧光。

小贴士

●建议进行不同基因转染时应对 PEI 和 DNA 的比例进行优化，以达到最适比例，通常筛选范围在 1:1 到 5:1 之间。

●通常情况下，分别准备 PEI 和 DNA 转染溶液时其体积一般是转染前每孔细胞培养液体积总量的 1/10-1/20，如细胞培养液体积为 3ml，则稀释 PEI 及 DNA 的体积为 150ul。质粒 DNA 的浓度通常为 1ug/ml（DNA 质量/细胞培养总体积）。

●不同质粒种类以及大小会影响转染效率，如较大片段插入质粒可能转染效率低，可根据实际实验需要调整，如适当增加转染质粒总量等。

●HEK293 GnTI 细胞重悬浮可用枪头或移液管反复吹打，但 CHO-S 细胞的粘附性比较强重悬浮时需要借助细胞刮刀。

●一般建议用胶原酶消化细胞，如果表达的是膜蛋白，胰酶消化细胞可能会降低蛋白表达，建议用胶原酶消化细胞，我们推荐用(LS004196，WORTHINGTONG)的胶原酶。

●对于贴壁性低的细胞系，可用明胶或鼠尾胶铺板，增加细胞与培养皿之间的粘附性。

●一旦确定了细胞类型、培养基和 PEI 与 DNA 的最佳比例，就可以在转染后 24 至96 小时内多次观察转染效率，以优化最大表达量时间点。

二、悬浮细胞转染

离心对数期生长的细胞用新鲜的培养基重悬浮使细胞密度达到 1×10⁶cells/mL 小规模转染时，如需大规模转染细胞密度要到达 2-3×10⁶cellsml/mL，可参考文献[4]。以 293F 细胞于 100mL 培养瓶（溶液体积占瓶体积的 1/5）操作体系举例如下：

（一）转染前准备

1) HEK293F 细胞传代接种于 20mL 悬浮细胞生长培养基中(36.5℃，120rpm，5%CO2)的条件下培养。当细胞密度到 1X106cells/mL，然后旋紧瓶口放入摇床继续培养，2~4 小时后可以进行转染。

（二）转染过程

2)用 1mlOptiPRO™SFM(无血清培养基)稀释适量的 DNA，使 DNA 终浓度为 1ug/ml（DNA/总培养体积）。混匀并静置 5min。

3)用 1mlOptiPRO™SFM(无血清培养基)稀释适当比例的 PEI40000，混匀并静置 10min。（PEI：DNA 参考比例范围，可参考上述贴壁细胞 PEI 和 DNA 优化方案优化）。

4) 将 24765-1转染试剂加入到稀释的质粒中轻轻混匀，室温孵育 30 分钟。

5)将 PEI-DNA 转染复合物逐滴加入到细胞培养液中，摇匀后旋紧瓶口放回摇床（36.5℃，5%CO₂，120rpm）。

6)基因表达可在 24-72 小时后检测，具体时间取决于细胞系和转基因。

小贴士

在悬浮培养中，单个细胞的转染效率要高于聚集在一起的细胞，需要优化适合单细胞的 生长条件。

方形瓶应经过两个连续的干燥循环高压灭菌（每个 45 分钟，干燥 15 分钟） 盖子应尽可能松，不得脱落。应该让它们冷却拧紧盖子前，将其完全放入层流罩中。如 果瓶子向内塌陷，细胞将无法正常生长。

如果要获得更多的蛋白产量，有参考文献表明转染后 24 小时，可以适当稀释细胞，稀释比例参考范围（1:2—1:5）之间，可以增加蛋白产量，稀释效应与最佳稀释比率应根 据经验确定[1][4]。

可以把 DNA 和 PEI 转染试剂直接加入到细胞悬液中进行转染，但必须经过上述 特定流程的 DNA 和转染试剂的比例和用量的相应优化。

PEI 是一种优化的线性阳离子聚合物转染试剂分子量分别为 25000 和40000。40000 相 比 25000 转染效率高，但毒性也略大于 25000。在 HEK293和 CHO 的蛋白表达系统中，相 比于市面上的脂质体 PEI 都表现出高的蛋白表达量（无论是 96 孔板还是 100L 的细胞反应 器），以及更小的细胞毒性、更高的转染效和更高的可重复性，并且十分经济的高性价比 转染试剂。产品具有以下特点：

●转染效率高，细胞毒性低；

●蛋白表达量高；

●节约成本：PEI 至少能够降 40% 的转染试剂总成本；

●适用于 HEK293 等真核细胞的转染；

●适用于贴壁细胞和悬浮细胞的转染；

●适用于有血清和无血清的转染条件；

●无机试剂 ，无动物源成分；

●产品稳定，质控严格；

●工艺流程适用范围广，容易优化 适合小规模培养板，培养瓶到大规模的生物反应器。

24765-1（在游离碱中也称为 PEI22K）是一种功能强大，值得信赖且经济实惠 的瞬时转染试剂。在 HEK293 和 CHO 大多数表达系统中，PEI MAX 都能提供稳定的高表 达（96 孔板至 100L 生物反应器）。现在每年有更多的研究人员和公司选择使用 PEI MAX 进行细胞转染，因为相对于大多数转染试剂而言 PEI MAX 既能得到稳定的高表达又能 使转染成本降低最少 40%。

40000 比更 25000 易于使用，并且比 25K 有更高的转染效率， 通常 24765-1转染过程通常需要几个小时才能完成准备，而 24765-1可在两小时内完成整 个转染过程。另外，PEI25000 含有 4-11％的残留丙酰基，这可能阻碍聚合 物主链与 DNA 的有效结合，而 24765-1的丙酰基完全脱落，意味着 24765-1 每批产品的性能更加稳定。

表 1 可借鉴的转染参数（96-孔板- 5L 生物反应袋[4]）

注意

本手册仅为 PEI 基本操作说明指导。基于 PEI 的转染效率受多种因素影响， 包括 PEI/DNA 复合物的制备方式、 PEI 与 DNA 的比例、DNA 浓度、 PEI 溶液的储存条件等。本手册不能覆盖 PEI 转染涉及的所有问题，只能根据主要影响因 素，如 PEI/DNA 比例 PEI 和 DNA 的浓度，孵育时间等提供相应的操作指南，以提高其 效率、重复性和一致性。如果我们提供的 PEI 手册无法回答您的问题，建议您查阅更 多参考资料，调整转染条件，为自己的实验找到合适的转染方法。

1 Patti A. Longo, Jennifer M. Kavran, Min-Sung Kim, and Daniel J. Leahy: Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethylenimine (PEI).Methods Enzymol. 2013 ; 529: 227–240.2

2 Shaozhe Yang,Xiaoling Zhou,Rongxiang Li, Xiuhong Fu, and Pingnan Sun: Optimized PEI-based Transfection Method for Transient Transfection and Lentiviral Production. Current Protocols in Chemical Biology 9:147–157, September 2017.

3 Yves Durocher，Sylvie Perret and Amine Kamen: High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1cells. Nucleic Acids Research,2002,vol.30,No.2.

4 Céline Raymond,Roseanne Tom ,Sylvie Perret ,Pascal Moussouami, Denis L’Abbé,Gilles St-Laurent ,Yves Durocher: A simplifified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications.Methods 55 (2011) 44–51.