【Miltenyi】REAfinity™重组抗体：为流式应用而生

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Miltenyi VioBright REAfinity™抗体

REAfinity™抗体

REAfinity™抗体是重组基因工程改造抗体，与小鼠或大鼠杂交瘤来源的单克隆抗体相比，具有更高的批次稳定性和纯度，并且通过基因改造极大限度地降低了背景信号。另外，REAfnity™抗体的Fc段均为人IgG1亚型，在流式分析中仅需选用通用型的同型对照抗体,实验设计更加简便。

新选择一一REAfinity™重组基因工程改造抗体

图1. REAfinity™重组基因工程改造抗体的生产流程示意图

将传统的小鼠或大鼠杂交瘤来源的单克隆抗体的抗原结合区序列与人IgG1 Fc段序列结合，得到经过基因工程重组的REAfinity™抗体的基因序列(图1)。同时，为了消除流式分析中的背景信号，此段人IgG1 Fc序列经突变改造，使其不会对Fcγ受体产生非特性结合。

为了保证抗体的纯度和批次稳定性，REAfinity™抗体是在一个成分明确的体外表达系统中生产的。经过突变改造的重组抗体序列，是在无血清、标准化条件下培养的哺乳动物细胞系中表达的，同时，为了确保批次间的稳定性，所有的REAfinity™抗体都是在相同的细胞系中表达，从而避免了因表达系统不同而引起的抗体质量差异。

符合重现性新标准

REAfinity™抗体的制造工艺保证了其高度稳定的质量和性能:

1.REAfinityTM抗体源于一段只编码一种重链和轻链的DNA序列，从而确保抗体的超高纯度（图2）。

2.在生化指标明确、标准化的培养条件下，由哺乳动物细胞表达，保证了抗体质量的批次间稳定性（图3 ）。

3.每个批次的产品都会经过严格的检验、生化和细胞水平的测试（图3 )。

图2：对抗体进行质谱分析，数据表明：REAfinity抗体纯度非常高，而杂交瘤来源的抗体是一种混合物。(A)对两个杂交瘤来源的单克隆抗体样本进行质谱分析，可以看出，它们都含有一条分子量接近23,635Da的污染轻链。(B)两个REAfinity抗体样本的质谱分析结果显示，其含有极高纯度的轻链。

图3:不同批次的REAfinity抗体染色结果几乎一致。用两个批次的5个CD56 REAfinity抗体,对同一供者来源的PBMC进行染色,然后用MACSQuant流式细胞仪检测。直方图中的两条曲线(黑色和红色)代表了两个不同批次的抗体,数据显示,不同批次的REAfinity抗体的染色结果几乎一致,从而证明其批次间稳定性极高。

极低的背景信号

所有REAfinity抗体的Fc段都经突变改造，从而消除了抗体与Fcγ受体的非特异性结合（图4）。因此，在流式分析中，无需额外增加阻断步骤，如添加FcR阻断试剂，也可以告别背景信号（图5、图6）。

图4：REAfinity抗体不会与Fcγ受体产生非特异性结合。本实验使用ELISA方法对抗体与5种细胞Fcγ受体的亲和力进行分析。小鼠杂交瘤来源的CD144单克隆抗体（深紫色）对FcγRI（CD64）受体显示出高亲和力，对FcγRIII（CD16）和FcγRII（CD32）受体显示出低亲和力。而REAfinity抗体（浅紫色）与Fcγ受体几乎没有结合。

图5：用REAfinity抗体进行细胞染色，即使不进行FcR阻断，也几乎没有背景信号。用小鼠来源的CD158a单克隆抗体或REAfinity CD158a抗体（克隆号：REA284）对同一供者来源的人PBMC进行染色。分别未使用（上）和使用（下）FcR阻断试剂。数据显示，小鼠来源的CD158a单克隆抗体与CD56阴性的细胞会产生非特异性结合（A），而使用REAfinity CD158a抗体则几乎没有非特异性的背景信号*。

图6：用REAfinity抗体进行细胞染色，即使不进行FcR阻断，也几乎没有背景信号。用仓鼠来源的Helios-FITC单克隆抗体或REAfinity Helios-FITC抗体（克隆号：REA829）对同一供者的人PBMC进行染色，分别未使用（上）和使用（下）FcR阻断试剂。在分析检测CD4+单核细胞亚群时，仓鼠来源的单克隆抗体会与Fc受体产生非特异性结合（A），而使用REAfinity抗体则几乎没有非特异性的背景信号*。

*使用MACSQuant®Analyzer 10流式细胞仪进行流式检测。分析前已通过散射光和PI染色设门排除了细胞碎片和死细胞的干扰。

通用型同型对照让流式实验更简单

所有REAfinity™抗体的恒定区都是由相同的、经突变改造的人IgG1序列构成，因此，进行流式分析时，只需选用一种类型的同型对照抗体即可，降低实验设计复杂度的同时，也更加节省时间。

相反，杂交瘤来源的单克隆抗体根据其来源不同，属于不同的亚型，因此，实验中经常需要设置多个同型对照组，不仅使试剂管理复杂化，也使实验配色的设计更加复杂。

图7:使用REAfinity抗体时,只需一种通用型同型对照,降低了实验设计的复杂程度。

适用于多色流式细胞分析的荧光染料

Vio®和VioBright™染料是一系列用于流式细胞分析和荧光显微镜成像的荧光染料，具有高荧光强度和低溢出的特点，是多色流式应用的理想选择。另外，Vio和VioBright染料与FITC，PE，PerCP和APC等传统的荧光染料串联，扩展了荧光染料的选择范围，让您在设置多参数细胞分析时更具灵活性。偶联了荧光染料的MACS®抗体非常适合鉴定和计数人类，小鼠，大鼠或非人类灵长类动物的细胞。