【Merck】FASP样品制备方法

蛋白质组研究在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径，是当前生物制药发展非常迅速的热门领域之一。

质谱（MS）技术是在蛋白质组研究的高通量分析中广泛使用的“金标准”，在该工作流程中，上机前的样品制备和前处理对获得准确和深度的分析结果尤其重要。

传统的样品制备方法包括胶内酶解和溶液内酶解，其中胶内酶解是非常强大的技术，而溶液内酶解更容易自动化，并最大限度地减少样品处理。2009年Matthias Mann小组发表的过滤辅助蛋白质组制备方法(Filter-Aided Sample Preparation，FASP)则结合了二者的优点，且通过对操作过程大大简化，提高了酶切的简便性、成功率与重现性。

FASP样品制备方法可以对用洗涤剂溶解的生物样品进行无凝胶处理，借助超滤膜对大分子质量的蛋白或多肽进行截留或通过，使酶解反应在尽量少的容器中完成。在过滤器上消化后洗脱的肽是纯净的，允许进行细胞器的单次分析和前所未有的蛋白质组覆盖深度，已成为备受青睐的蛋白质组学研究的操作流程。

经过十余年的广泛应用，根据不同的样本类型、样本特点、研究目的等，研究人员对FASP法进行了不断的调整和优化，但基本流程和操作方法都是类似的，如下方案供参考。

●SDT-lysis buffer: 4%(w/v) SDS, 100mM Tris/HCl pH 7.6, 0.1M DTT

●UA溶液: 8 M尿素 (货号：U5128) 溶于 0.1 M Tris/HCl, pH 8.5

●UB溶液: 8 M尿素 (货号：U5128) 溶于0.1 M Tris/HCl, pH 8.0

●IAA溶液: 含0.05 M 碘乙酰胺的 UA

●Lys-C内切蛋白酶（货号：ENDOLYSS-RO）: 5 µg/µl储存液

●胰蛋白酶（货号：T1426）: 0.4 µg/µl储存液

●0.5M NaCl水溶液

●ABC溶液: 0.05M NH4HCO3水溶液

●过滤装置: 30kDa Microcon® 超滤管(货号：MRCF0R030) 或10kDa Microcon® 超滤管(货号：MRCPRT010)

●C18-SD萃取装置: 7mm/ 3 ml

备注: UA, UB和IAA solutions must be prepared freshly and used within a day.

1:10比例使用SDT-裂解缓冲液在95°C下裂解细胞或组织3-5分钟，使用超声法剪切DNA以降低样品的粘度。在开始样品处理之前，裂解液必须在16000 x g离心5分钟澄清。

1.混合最多30µl的蛋白质提取物与200µl的UA并加入Microcon® 超滤管中，14,000 x g离心40分钟

2.再往过滤装置中加入200µl的UA, 14,000 x g离心40分钟

3.丢弃收集管中的滤液

4.加入100 µl IAA溶液，在热混合器中以600 rpm混合1 min，然后静止孵育5 min

5.将超滤装置14000 x g离心30分钟

6.加入100 µl UB, 14000 × g离心40分钟，重复此步骤2次

7.加入40 µl含Lys-C(酶蛋白比1:50)的UB，在热混合器中以600 rpm混匀1 min

8.在保湿箱中孵育过夜

9.将超滤装置转移到新的收集管中

10.加入120 µl ABC和胰蛋白酶(酶蛋白比1:100)，在热混合器中600 rpm混匀1 min

11.室温下孵育4小时

12.将超滤装置14000 x g离心40分钟

13.加入50 µl 0.5M NaCl，超滤装置14000 x g离心20 min

14.流穿液用CF3COOH酸化并脱盐

三. 多肽脱盐

直接进行LC-MS分析的少量消化物可以使用ZipTips® (货号：ZTC18S096)脱盐。大量肽混合物必须使用SPE萃取柱进行脱盐，可参考如下步骤:

1.将3ml的SPE萃取盘(C18-SD) 放入15ml的锥形管中，或使用萃取小柱(货号：57089）

2.加入1ml CH3OH，1500 x g下离心1分钟

3.加入0.5 ml含 0.1% CF3COOH, 70% CH3CN的水溶液，1500 × g下离心1分钟

4.加入0.5 ml含 0.1% CF3COOH的水溶液，1500 x g下离心1分钟

5.加入上述滤液(步骤2.14) ，150 x g离心3分钟

6.加入0.5 ml含 0.1% CF3COOH的水溶液，150 × g离心3分钟

7.将萃取盘转移到新管中，加入0.5 ml含 70% CH3CN的水溶液，150 × g离心3分钟

8.收集脱盐的多肽洗脱液

四. 得率鉴定

可以通过紫外光谱仪估算多肽的浓度。

1.Wiśniewski et al. (2009). Universal Sample Preparation Method for Proteome Analysis. Nature Methods 6, 359-362.

2.Wiśniewski, Zielinska and Mann (2010). Comparison of Ultrafiltration Units for Proteomic and N-glycoproteomic Analysis by the Filter-Aided Sample Preparation Method. Analytical Biochemistry 410(2), 307-309.

3.Ledvinová et al. (2018) Filter-Aided Sample Preparation Procedure for Mass Spectrometric Analysis of Plant Histones. Front. Plant Sci. 9:1373.