【Merck】HA标签融合蛋白的亲和纯化
HA序列仅有9个氨基酸，来源于流感病毒血凝素表位，分子量为1.1kDa。已经建立成熟的基于抗体的纯化和检测体系。由于HA 很小，广泛用于重组蛋白表达纯化（亲和纯化和 IP）和检测（WB和ELISA）。作为精细化蛋白互作研究，HA 和FLAG组合成双标签，用于TAP（串联亲和纯化）
Anti-HA单抗琼脂糖偶联物可以识别天然或表现/还原的HA（血凝素）融合蛋白，无论蛋白在大肠杆菌或哺乳动物细胞中表达，在融合蛋白的N或C端都不受影响。
下面介绍用Anti-HA单抗琼脂糖亲和纯化HA标签融合蛋白的操作方法：
需要的试剂及设备
• 单克隆抗HA琼脂糖（货号A2095）
• 含有HA标签融合蛋白的样品
• HA多肽（货号I2149）
• 硫氰酸钠（货号S7757）
• 甘氨酸盐酸盐（货号G2879）
• 蛋白酶抑制剂混合物（通用于细菌、哺乳动物、真菌及酵母、植物以及组织培养物）（货号P2714, P8465, P8340, P8215, P9599和P1860)
• 色谱柱
• 分光光度计
操作指南
HA标签融合蛋白的柱纯化前对柱子预平衡，所有缓冲液和操作步骤在室温下放置和进行。为了减少堵柱，含有染色体DNA或RNA的很粘稠的样品可以先进行超声处理或核酸酶消化以降低粘度，离心和过滤去掉样品中的颗粒物和细胞碎片。
如果蛋白稳定性对温度敏感，以下操作可在2-8℃进行。
A.组装柱子
1. 固定好空的色谱柱。
2.在柱子下端接上排水管用来控制流速。管子不要超过25cm。
3.去掉柱子上下端的封片，用PBS,pH 7.4浸洗。让缓冲液流出柱子，并留下少量PBS缓冲液以便于装载Anti-HA琼脂糖
B. 装填树脂
1. 充分重悬anti-HA琼脂糖使其呈均匀的悬浊液状态。
2. 立即将需要的树脂悬浊液转移到柱子。
3. 让树脂形成柱床并以PBS浸润。
4. 在柱子上加PBS再次使其从柱子流出。不要让柱子干掉。
C. 清洗柱子
连续3次用5ml glycine-HCl, pH 2.5（或3M硫氰酸钠，目录号S7757）清洗，再用5ml PBS连续3次洗涤。加入缓冲液时避免扰动琼脂糖柱床。缓冲液完全流出后在加入后续洗液。柱子在glycine-HCl中不要超过20min。
D. 将HA融合蛋白结合到柱子上
1. 重力流下上样（已中和至pH7-8）到柱子上，或者采用蠕动泵把速度控制在0.5ml/min。
2. 收集“流穿”的未结合蛋白。
3. 用PBS洗柱直至A280 ≤ 0.01。
E. 洗脱HA融合蛋白
以下方法任选其一即可
E1. Glycine-HCl, pH 2.5洗脱
用10X1ml 0.1M glycine-HCl, pH 2.5洗脱HA融合蛋白，每份洗脱产物加到含30-50μl 1M Tris缓冲液
E2. HA多肽洗脱
这是一个较为温和的洗脱方式。采用5倍柱体积含100μg/ml HA多肽（目录号I2149）的PBS洗脱结合的HA标签融合蛋白。
F. 柱子再生
建议使用后立即对柱子做再生处理：用3体积glycine-HCl, pH 2.5洗柱，用PBS再平衡直至流出液pH为中性。
G. 柱子的储存
用PBS洗柱子3次，柱子在PBS（含15mM叠氮钠）中存放于2-8℃。
默克生命科学提供HA亲和蛋白免疫沉淀试剂盒、纯化树脂和检测抗体：
类型 | 产品描述 | 特点 | 包装 | 目录号 |
IP 试剂盒 | Anti-HA Immunoprecipitation Kit | 采用CelLytic M高效裂解哺乳动物细胞，并用甩柱法高特异性地进行HA融合蛋白免疫沉淀，操作方便，数据稳定 | 50次 | IP0010 |
树脂 | Monoclonal Anti-HA Agarose antibody produced in mouse | 纯化的鼠源HA单抗，推荐用于亲和纯化和免疫沉淀，结合载量30-50nmol/mL，洗脱采用20-50nmol/mL | 1mL, 5×1mL | A2095 |
红色树脂 | EZview™ Red Anti-HA Affinity Gel | 载量≥0.4mg/mL，推荐用于免疫沉淀。特别设计为亮眼的红色，减少样品丢失，提高操作方便性和数据稳定性 | 1mL, 5×1mL | E6779 |
洗脱肽 | HA Peptide | 合成多肽冻干粉，竞争性洗脱HA融合蛋白，用于亲和纯化和染色质免疫沉淀 | 5mg | 11666975001 |
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