【Ucallm】Ucell™ Cell Counting Kit(CCK-8)

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Ucallm Ucell™ C2716-001 C2716-005 C2716-0100 CCK-8 Ucell™ Cell Counting Kit

Ucell™ Cell Counting Kit(CCK-8)

CCK-8 检测试剂盒

产品描述

Ucell™ Cell Counting Kit（CCK-8）是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4- 硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分，酚红和血清对检测不会造成干扰。WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物formazan。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。

WST-8 对细胞无明显毒性。加入CCK-8 溶液显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，检测时间更加灵活，便于确定最佳测定时间。

本试剂盒尤其适用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等，可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。

产品特色

比 MTT，MTS 或 WST-1 更敏感，数据可靠，重复性好
无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低
即开即用，操作更简单，无需有机溶剂，省时省力
稳定性高，2-8℃避光保存效期长达3年

Order Information 订货信息

货号	产品名称	产品描述	产品包装
C2716-001	CCK-8 检测试剂盒	100T	1mL/管
C2716-005	CCK-8 检测试剂盒	500T	5×1mL/瓶
C2716-0100	CCK-8 检测试剂盒	10,000T	100×1mL/瓶

存储条件

-20°C 干燥避光冻存，有效期长达五年。

2-8°C 干燥避光保存，有效期至少三年。

反复冻融会导致背景增加，干扰您的检测。如果频繁使用，请将试剂盒存放在 2-8°C。

操作步骤

1. 制作标准曲线

a. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；

b. 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 5-7 个细胞浓度梯度，每组 4-6 个复孔；

c. 接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后每100μL培养基加10μL CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD 值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致。

2. 细胞活性检测

a. 在 96 孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)，将培养板放在培养箱中预培养24小时；

b. 向每孔加入10μL的CCK-8 溶液(注意不要产生气泡）；

c. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；

d. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

3. 细胞增殖-毒性检测

a. 在96孔板中接种细胞悬液 (100μL/孔)，将培养板放在培养箱中预培养24小时；

b. 向培养板加入不同浓度的待测药物；

c. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；

d. 向每孔加入10μL 的CCK-8溶液 (注意不要产生气泡)；

e. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；

f. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

4. 计算公式

细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液) ；

Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含药物) ；

Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、药物) 。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

注意事项及重要提醒

1. CCK-8的培养时间一般为1-4小时，但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度，根据细胞种类而定，需要摸索条件，CCK-8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。

注意：白细胞可能需要培养较长时间。

2. 使用96孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

3. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

4. 加入药物中如含有金属，对CCK-8显色有影响。终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。

5. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

6. 本产品可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100μL E.coli培养液中加入10μL CCK-8溶液，并培养1-4小时或过夜。

7. CCK-8试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，OD值不断增加(注：活细胞内的脱氢酶是持续产生的)。

8. 要测定细胞的具体数量，建议同时做标准曲线。

9. 建议采用多通道移液器，以减小平行孔间的差异。

10. 以下方法可以终止CCK-8反应(96孔板)：

(a)在显色反应后，将培养板放置4°C冰箱内。
(b)每孔加10μL 0.1 M HCl溶液。
(c)每孔加10μL 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。

注意：反应停止后，应在24小时内测定。

11. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

12. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

常见问题解答 (FAQs)

1）Q：每个孔需要接种的细胞数量是多少？

A：对于贴壁细胞，每孔至少需要1000个细胞（100 μL培养基）。对于白细胞，由于灵敏度较低，每孔至少需要 2500 个细胞（100 μL 培养基）。推荐的 96 孔板每孔最大细胞数为 25000。如果使用 24 孔或 6 孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整 CCK-8 的体积，使其为每孔总液体体积的 10%。

2）Q：CCK-8 对细胞的毒性大小如何？

A：CCK-8 的毒性非常低，在 CCK-8 测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或 DNA 荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐把 CCK-8 测定过的细胞用于其它实验。）

3）Q：怎么设置空白对照？

A：在不含有细胞的培养基中加入CCK-8，酶标仪检测 450 nm 的吸光度；若做药物刺激实验，可在不含细胞、含药物的培养基中加入CCK-8。酶标仪检测450 nm 的吸光度作为空白对照。

4）Q：CCK-8 能否用于细胞染色？

A：CCK-8 不能用于细胞染色，CCK-8 检测原理是高水溶性的四唑盐 WST-8 在电子耦合试剂存在下还原产生水溶性 formazan 形式的染料，WST-8 及 formazan 是高度水溶性的，不会进入细胞内对细胞进行染色。

5）Q：没有 450 nm 的滤光片，能否使用其他滤光片？

A：如果您没有450 nm滤光片。您也可以使用吸光度在 430 nm 和 490 nm 之间的滤光片, 450 nm 滤光片具有最佳灵敏度。

6）Q ：哪些物质会干扰 CCK-8 的测定？

A：WST-8 可能与还原剂反应生成 WST-8 formazan ，如果使用还原剂（例如一些抗氧化剂）会增加 OD 值；若存在氧化性物质则会抑制 CCK-8 测定反应，减小 OD 值；此外，培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

7）Q：在做药物刺激实验时，药物对测定是否有影响？

A：如果药物有还原性，则会与 CCK-8发生反应，影响吸光度；药物中金属离子的存在可能会影响CCK-8的灵敏度。终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10 mM的话，将会 100%抑制。