【Ucallm】Ublot™ PVDF膜产品说明

Ublot™ PVDF 膜是一种聚偏氟乙烯 (PVDF) 微孔膜，用于从各种凝胶基质中转移蛋白质。与硝酸纤维素膜相比，它具有更佳的操作性能。

这款疏水膜有两种孔径：0.45μm 和 0.22μm，使其能够结合各种分子量范围的蛋白质：

• 0.45μm孔径：适用于大多数蛋白质，提供更高的检测灵敏度。

• 0.22μm孔径：适用于分子量小于20,000的蛋白质，确保更好地吸附和保留小分子蛋白质。

Ublot™ PVDF 膜具有出色的蛋白质保留性、高物理强度和广泛的化学相容性，使其成为免疫测定的最佳选择。

1. 建议根据凝胶尺寸裁剪Ublot™ PVDF膜。

2. 使用前需用甲醇润湿干燥的膜。

3. 超纯水。

4. 转印缓冲液：

• 槽内转移：25 mM Tris 碱，192 mM 甘氨酸，pH 8.3，含 10-20% 酒精。

• 干转移：48 mM Tris，39 mM 甘氨酸，pH 9.2，含 10-20% 酒精。

5. 将滤纸剪至凝胶大小，浸泡在转印缓冲液中至少 30 秒。

6. 封闭缓冲液：市售快速封闭剂或 0.5-5% 洗涤缓冲液封闭剂（牛血清白蛋白、酪蛋白或脱脂奶粉）。

7. 洗涤缓冲液：

• 含0.05-0.1% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS）或Tris缓冲液（TBS）（PBST或TBST）。

• PBS成分：10 mM磷酸钠，pH 7.2，0.9% NaCl。

• TBS成分：10 mM Tris，pH 7.4，0.9% NaCl。

8. 针对目标蛋白的特异性一抗，用市售抗体稀释剂、封闭缓冲液或洗涤缓冲液稀释。

9. 针对一抗的特异性二抗，用检测酶（例如辣根过氧化物酶 [HRP] 或碱性磷酸酶 [AP]）标记，用市售抗体稀释剂、封闭缓冲液或洗涤缓冲液稀释。

1. 处理膜时务必佩戴手套，以免留下指纹。

2. 使用钝镊子，以免损坏膜。

3. 切割或处理膜时，请保留保护纸（浅蓝色纸），但膜润湿后请丢弃。

4. 小心处理膜，避免刮伤表面，切勿折叠。

5. 疏水性 Ublot™ PVDF 转印膜必须预先用甲醇溶液润湿。润湿后，膜会从不透明变为半透明。

6. 蛋白质转印后，用超纯水清洗印迹膜以去除残留碎屑。

7. 印迹膜可风干后在 4°C 下保存数月（以备将来使用）或立即使用。

转印缓冲液中的醇（甲醇、乙醇或异丙醇）有两个重要作用：稳定凝胶尺寸和去除蛋白质分子上络合的十二烷基硫酸钠 (SDS)，从而增强蛋白质与膜的结合。

然而，对于较大的蛋白质或存在溶解性问题的蛋白质，建议降低醇浓度并在转印缓冲液中添加少量 SDS。这种调整可以改善蛋白质从凝胶中的洗脱，同时保持其在转印过程中的溶解性。

免疫测定是一种基于抗体的技术，用于定量检测和鉴定印迹膜中的蛋白质或抗原。该过程包括以下步骤：

1. 封闭未占据的膜位点，以防止非特异性抗体结合。

2. 将膜与可结合目标蛋白的一抗孵育。

3. 清洗以去除任何未结合的一抗。

4. 将膜与可结合一抗的偶联二抗孵育。

5. 清洗以去除任何未结合的二抗。

6. 将膜与可与偶联二抗反应的底物孵育，从而揭示目标蛋白的位置。

1. 将干膜放入甲醇中浸湿 10-20 秒，直至其从不透明的白色变为均匀的半透明灰色。

2. 将膜浸泡在超纯水中 1-2 分钟，以去除酒精残留。

3. 将膜放入转印缓冲液中平衡 2-3 分钟，直至可以使用。

使用提醒：

• 膜润湿后，请勿使其变干。它可以留在缓冲液中，直到蛋白质转移完成。

• 如果膜即使部分变干（变成不透明的白色），也必须重复步骤 1-3 重新润湿。

1. 将蛋白质混合物涂抹在聚丙烯酰胺凝胶上。

2. 将凝胶浸泡在转印缓冲液中，使其平衡 10-15 分钟。

3. 根据所用转印设备制造商的说明组装转印膜组。

4. 按照转印设备制造商的指南转移蛋白质。

5. 从转印系统中取出印迹膜，并用超纯水快速冲洗膜以去除凝胶碎片。

6. 印迹膜可以风干保存或立即用于免疫检测。

使用提示：

• 为确保转印均匀，请用干净的移液器或印迹滚筒小心地在每层印迹的表面滚动。避免用力过猛，否则可能会损坏凝胶和膜。

• 在免疫检测前干燥印迹膜可以增强蛋白质结合力并降低背景噪音。

成功进行蛋白质印迹实验的一些关键因素，例如蛋白质浓度、封闭液和抗体浓度，可能需要在以下方案中进行优化。

标准免疫检测

1. 如果印迹已干，请将其重新浸湿，浸泡在甲醇中 15 秒，或直至其颜色从不透明的白色变为半透明的灰色。

2. 用超纯水冲洗印迹 1 分钟。

3. 将印迹放入封闭缓冲液中，轻轻搅拌孵育 1 小时。

4. 将一抗稀释于市售抗体稀释液、洗涤缓冲液或封闭缓冲液中。

5. 将印迹放入稀释的一抗溶液中，室温孵育 1 小时（或 4°C 过夜），轻轻搅拌。

6. 使用洗涤缓冲液（含 Tween®-20 表面活性剂的缓冲液（TBST 或 PBST））洗涤印迹 3-5 次，每次 5 分钟。

7. 将二抗稀释于市售抗体稀释液、洗涤缓冲液或封闭缓冲液中。

8. 将印迹膜放入稀释的酶联二抗溶液中，室温孵育1小时。

9. 用洗涤缓冲液洗涤印迹膜3-5次，每次5分钟。

10. 将印迹膜放入干净的容器中，并加入相应的检测试剂。

11. 按照检测试剂制造商的说明，孵育1-5分钟。

12. 对于HRP或AP化学发光试剂，将印迹膜暴露于X光胶片或使用成像系统获取数字图像。

13. 对于显色检测，加入试剂并等待信号出现。

下表提供了针对特定蛋白质印迹应用的建议。由于蛋白质的特性（例如电荷密度、构象和疏水性）存在差异，并非所有蛋白质在膜表面的表现都相同。因此，您可能需要使用不同的 Ublot™ PVDF 膜进行实验，以优化您特定应用的结果。